El músculo liso vascular RhoA contrarresta la formación de aneurisma aórtico abdominal al modular la actividad de MAP4K4

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1071 (2022) Citar este artículo

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No se ha determinado si una pequeña GTPasa RhoA juega un papel en la patología del aneurisma aórtico abdominal (AAA). Mostramos aquí que la expresión de RhoA se reduce en las lesiones AAA humanas, en comparación con las áreas normales. Además, la incidencia de la formación de AAA aumenta en ratones con knockout condicional (cKO) RhoA específicos de células de músculo liso vascular (VSMC). La contractilidad de los anillos aórticos y las VSMC de ratones RhoA cKO se reduce, y la expresión de genes relacionados con la contractilidad de las VSMC se ve atenuada por la pérdida de RhoA. El agotamiento de RhoA activa la señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAP), incluida MAP4K4, en la aorta y las VSMC. La inhibición de la actividad de MAP4K4 por DMX-5804 disminuye la formación de AAA. Set, una proteína de unión a RhoA activa, funciona como activador de MAP4K4 secuestrando PP2A, un inhibidor de MAP4K4, en ausencia de RhoA. En conclusión, RhoA contrarresta la formación de AAA mediante la inhibición de MAP4K4 en cooperación con Set.

El aneurisma aórtico abdominal (AAA) provoca rotura aórtica y muerte súbita y, por lo tanto, es una enfermedad vascular potencialmente mortal1. El AAA se forma por varios factores, como la alteración de la generación de fuerza de las células del músculo liso vascular (VSMC), la degradación y fragmentación de las fibras elásticas, la pérdida de las VSMC mediales y la inflamación2,3. El deterioro de la contractilidad de las VSMC puede ser un importante factor promotor del AAA. Se ha demostrado recientemente que las VSMC de pacientes con AAA tienen una contracción máxima alterada, en comparación con las VSMC de control no patológico4. Para responder al estrés mecánico, las VSMC expresan altos niveles de proteínas contráctiles, como la α-actina del músculo liso (α-SMA o ACTA2) y la cadena pesada 11 de miosina del músculo liso (MYH11), y estas células son esenciales para la estabilización de la pared aórtica. . Además, las proteínas contráctiles y sus moléculas relacionadas contribuyen a la distribución de fuerza en la aorta al regular las propiedades mecánicas a través del enlace con la matriz extracelular (MEC)5. Por el contrario, la generación reducida de fuerza de VSMC mejora la actividad de las metaloproteinasas de matriz (MMP) y la secreción de citocinas/quimiocinas inflamatorias6,7,8. Para prevenir la formación de AAA, se considera importante mantener saludables las VSMC. Sin embargo, no está completamente claro cómo se regula la capacidad contráctil de VSMC.

RhoA es una GTPasa que se expresa abundantemente en VSMC9,10. La actividad de RhoA está regulada por su ciclo entre la forma activa unida a GTP y la forma inactiva unida a GDP11. Para activar RhoA, los factores de intercambio de nucleótidos de guanina inducen la liberación de GDP de RhoA, lo que resulta en la captura de GTP del citosol. El RhoA activado luego transduce señales a los efectores aguas abajo12. Para la inactivación de RhoA, las proteínas activadoras de GTPasa (GAP) estimulan enérgicamente la actividad de hidrólisis intrínseca de RhoA para hidrolizar GTP a GDP. RhoA tiene múltiples funciones en la regulación de las VSMC y contribuye al soporte morfológico y al mantenimiento de la estructura aórtica13. La quinasa que contiene bobina enrollada asociada a Rho (ROCK), una molécula corriente abajo de RhoA, media la mayoría de las funciones de RhoA, incluida la dinámica de la actina, la contracción celular y la motilidad celular14. Las disfunciones de RhoA/ROCK se han relacionado con la patogenia de la arteriosclerosis, la lesión isquémica, la hipertensión pulmonar y la insuficiencia cardíaca, lo que conduce al desarrollo de enfermedades cardiovasculares15. El papel de RhoA en la vasculatura a través de ROCK se ha investigado vigorosamente. Sin embargo, aún no está claro cómo RhoA en sí mismo en VSMC regula la homeostasis de la aorta.

Sobre la base de los antecedentes descritos anteriormente, examinamos los niveles de expresión de RhoA en las áreas normal y AAA de pacientes con AAA y encontramos que el nivel se redujo significativamente en la capa media del área AAA. Para explorar más a fondo la función de RhoA en las VSMC aórticas, se generaron ratones knockout condicionales (cKO) RhoA específicos de VSMC mediante el sistema Cre/loxP. La estimulación farmacológica indujo en gran medida la formación de AAA en ratones RhoA cKO, en comparación con los ratones de control. La pérdida de RhoA en las VSMC disminuyó significativamente la contractilidad de los anillos aórticos y las VSMC y la expresión de genes relacionados con la contractilidad, y aumentó la respuesta inflamatoria y la lesión endotelial, lo que condujo a los fenotipos proteolíticos e inflamatorios de las VSMC. Demostramos que la inhibición de la proteína quinasa quinasa quinasa quinasa 4 activada por mitógeno (MAP4K4) por RhoA en VSMC fue importante para la prevención de la formación de AAA. Nuestro análisis de proteómica ayudó aún más a aclarar el mecanismo molecular subyacente por el cual RhoA regulaba negativamente a MAP4K4.

Antes de examinar la expresión de RhoA en el AAA humano, confirmamos la alteración de la capa media y la pérdida de fibras elásticas mediales intactas en la pared aórtica de los pacientes con AAA mediante la tinción de Verhoeff Van Gieson específica con hematoxilina y eosina (HE) y elastina (Fig. 1a, b ). La inmunohistoquímica y la inmunotinción de la aorta revelaron que la expresión de RhoA se redujo notablemente en la capa media del área AAA en comparación con el área normal (Fig. 1c-f). De acuerdo con estos resultados, la qPCR y la transferencia Western de muestras de la pared aórtica mostraron una expresión significativamente menor de ARNm y proteína RhoA en el área AAA (Fig. 1g-i). Estas observaciones indican que la expresión de RhoA se reduce en el AAA humano y sugiere que la expresión reducida de RhoA puede estar involucrada en el desarrollo de AAA. Además, los niveles de expresión de VSMC y las proteínas marcadoras de células endoteliales α-SMA y CD31, respectivamente, se redujeron en el área AAA debido a la interrupción de las capas medial y endotelial de la pared aórtica, mientras que el nivel de la proteína marcadora de fibroblastos vimentina fue similar entre las áreas normal y AAA (Fig. 1h, i).

a Tinción con hematoxilina y eosina (HE) de áreas normales y de aneurisma aórtico abdominal (AAA) en la aorta humana. Los rectángulos punteados se amplían y se muestran en la parte inferior. b Tinción de Verhoeff Van Gieson de áreas normales y AAA. c Inmunohistoquímica de RhoA en áreas normales y AAA de la aorta. Los rectángulos punteados se amplían y se muestran en la parte inferior. d Gráfico resumen de la expresión de RhoA examinada en (c). n = 6 en Normal y n = 9 en AAA. e Inmunotinción de RhoA en áreas normales y lesiones AAA. La actina F y los núcleos se contrastaron con faloidina y DAPI, respectivamente. f Gráfico resumen de la expresión de RhoA examinada en (e). n = 7 en Normal y n = 12 en AAA. g Análisis qPCR para RHOA mRNA obtenido de áreas normales y AAA. Se usó GAPDH como control. n = 11 en Normal y n = 15 en AAA. h Western blotting para RhoA y otras proteínas marcadoras en áreas normales y AAA. GAPDH sirvió como control de carga. i Gráficos de resumen de la expresión relativa de RhoA y otras proteínas marcadoras examinadas en (h). n = 6 en Normal y n = 8 en AAA. Barras de escala: 500 μm (a–c) y 30 μm (e). En (d, f, g, i), los datos entre los dos grupos se analizaron mediante la prueba t. ***p < 0,001 frente a la normalidad.

Para determinar si la expresión alterada de RhoA en la capa media de la aorta contribuye al desarrollo de AAA, generamos ratones RhoA cKO específicos de VSMC utilizando el sistema Cre/loxP. Los ratones RhoA cKO mostraron un crecimiento normal y nacieron en proporciones mendelianas; los ratones no mostraron ninguna diferencia fenotípica importante, incluida la fertilidad, en comparación con los controles de camada. Confirmamos la ausencia de expresión de RhoA en la capa media de la aorta del ratón RhoA cKO mediante tinción de inmunofluorescencia (Fig. 1a complementaria). El estudio hemodinámico mostró una frecuencia cardíaca y una presión arterial sistólica (PA) similares entre los ratones de control y RhoA cKO al menos mediante una verificación puntual utilizando el método de manguito de cola (Fig. 1b complementaria). La apariencia externa de la aorta era clara tanto en el control como en los ratones RhoA cKO, y no se formó AAA (Fig. 1c complementaria). La observación ultrasonográfica no detectó una dilatación significativa o una diferencia en el diámetro de la aorta abdominal entre los ratones control y RhoA cKO (Fig. 1d, e complementarias). Además, la tinción de HE y Verhoeff Van Gieson mostró aortas intactas tanto en ratones control como RhoA cKO (Fig. 1f, g complementarias). La tropoelastina, codificada por el gen Eln, y la fibrilina-1, codificada por el gen Fbn1, son los principales componentes de la capa media de la aorta y desempeñan un papel en la regulación de la elasticidad aórtica16. Los niveles de ARNm de Eln y Fbn1 fueron similares en la aorta entre ambos tipos de ratones (Fig. 1h complementaria). Examinamos más a fondo la producción de colágeno y el entrecruzamiento de colágeno en las muestras de aorta de ratón, que pueden afectar la fuerza de la pared aórtica, mediante qPCR y ensayo de hidroxiprolina. El nivel de ARNm de colágeno tipo I α1, el componente principal del colágeno tipo I, fue similar entre las aortas de ratones control y RhoA cKO. El ensayo de hidroxiprolina también mostró que el colágeno total y el colágeno reticulado estaban contenidos de manera equivalente en las aortas de ambos tipos de ratones (Fig. 1i, j complementarias). Estos resultados sugieren que, en condiciones normales, la pérdida de RhoA en las VSMC no afecta la morfología y función de la aorta al menos durante los seis meses posteriores al nacimiento.

Se ha informado que la actividad de la recombinasa Cre impulsada por el promotor SM22α se observó en el corazón, así como en VSMC en ratones17, y que la inactivación del gen objetivo se mostró en el corazón de tales ratones cKO18. Con base en estas publicaciones anteriores, verificamos la expresión de RhoA en el corazón de embriones y ratones adultos. La expresión de RhoA en realidad se redujo, pero no se perdió por completo, tanto en los corazones en desarrollo como en los adultos de los ratones RhoA cKO, en comparación con los de los ratones de control (Fig. 2a-d complementaria). A pesar de la expresión reducida de RhoA en el corazón, se mantuvieron la contractilidad y las dimensiones cardíacas en ratones adultos RhoA cKO (Fig. 2e complementaria), lo que sugiere que un grado de reducción de la expresión cardíaca de RhoA en ratones RhoA cKO no afecta la función cardíaca.

Con base en los resultados de los ratones RhoA cKO descritos anteriormente, a continuación examinamos la importancia biológica de RhoA en VSMC bajo estimulación farmacológica. Se administraron angiotensina II (AngII) y β-aminopropionitrilo (BAPN) a ratones control y RhoA cKO utilizando minibombas osmóticas durante 4 semanas para inducir AAA. No se observaron diferencias en el peso corporal, la frecuencia cardíaca y la PA sistólica medida por el método de manguito de cola entre los grupos durante la administración de AngII y BAPN (Fig. 2a). Sin embargo, la incidencia de formación de AAA fue significativamente mayor en ratones RhoA cKO que en ratones de control (Tabla 1 y Fig. 2b). Analizamos más a fondo los ratones de control en los que se formó AAA y descubrimos que la expresión de RhoA se redujo notablemente en el área de AAA en comparación con el área normal (Fig. 3a-c complementaria), lo que sugiere la importancia de RhoA para la prevención de AAA. Aunque la longitud de la aorta no fue diferente entre los ratones control y RhoA cKO (Fig. 2c), el diámetro de la aorta abdominal medido por ultrasonografía fue significativamente mayor en los ratones RhoA cKO en comparación con los ratones control (Fig. 2d, e). El análisis histológico mediante la tinción de HE y Verhoeff Van Gieson mostró que la interrupción y la degradación de la lámina elástica medial en la aorta fueron más graves en los ratones RhoA cKO que en los ratones de control (Fig. 2f-h). Además, los niveles de ARNm de Eln y Fbn1 se redujeron significativamente después de la infusión de Ang II y BAPN en ratones RhoA cKO en comparación con los ratones de control (Fig. 2i). Estudios previos han sugerido que un aumento anormal en la agregación de proteoglicanos en la aorta puede causar la interrupción de las interacciones entre la matriz celular, la mecanodetección aórtica comprometida y la integridad estructural, y puede ser un sello distintivo de la degeneración medial en la aorta19,20,21. Por lo tanto, realizamos una inmunotinción para detectar la expresión de agrecano en la aorta y descubrimos que la expresión estaba significativamente regulada y acumulada en el sitio de la ruptura aórtica en ratones RhoA cKO (Fig. 2j). Juntos, estos resultados sugieren que RhoA en VSMC tiene un papel protector contra la estimulación para formar AAA.

a Cambios en el peso corporal y la hemodinámica antes (semana 0) y después del tratamiento con AngII y BAPN. n = 14, cada grupo. b Aspecto externo de la aorta con el corazón y los riñones extraídos después del tratamiento de 4 semanas. Las flechas indican AAA formado. c Longitud de la aorta desde la válvula aórtica hasta la bifurcación de la arteria ilíaca común. d Observación ecográfica de la aorta abdominal, delimitada por líneas punteadas amarillas, después del tratamiento. e Gráfico resumen del diámetro de la aorta abdominal. n = 6, cada grupo. f Tinción HE de la aorta. g Tinción de Verhoeff Van Gieson de la aorta. h Gráfico resumen del grado de degradación de la elastina analizado en (g). n = 5, cada grupo. i qPCR análisis de genes relacionados con la elasticidad aórtica. n = 13 en Control y n = 10 en RhoA cKO para Eln, y n = 10 en Control y n = 8 en RhoA cKO para Fbn1. j Coinmunotinción de agrecano y α-SMA en la aorta de ratón después del tratamiento. Los núcleos se contrastaron con DAPI. Puntas de flecha: posición de rotura del AAA (f, g, j). Barras de escala: 1 mm (d) y 100 μm (f, g, j). En (a), se aplicó ANOVA bidireccional o unidireccional para comparar los datos entre grupos y semanas, respectivamente, y en (c, e, h, i), los datos entre los dos grupos se analizaron mediante la prueba t . †p < 0,05, ††p < 0,01 y †††p < 0,001 frente a la semana 0; *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 frente al control.

A continuación, examinamos el papel de RhoA en las VSMC en la contractilidad de la aorta y las VSMC. Después de la infusión de solución salina o tanto de AngII como de BAPN durante 4 semanas, se midió la tensión isométrica de la aorta de ratón aislada mediante un miógrafo de alambre. Las aortas de los ratones de control resistieron la tensión más alta generada por el miógrafo de cables múltiples a niveles similares después de la infusión de solución salina y AngII+BAPN, mientras que las aortas de los ratones RhoA cKO eran frágiles y conservaron la tensión aórtica más baja independientemente del tratamiento con solución salina o AngII+BAPN (Fig. 3a). También realizamos un ensayo de contractilidad en gel de colágeno in vitro usando VSMC aisladas del control y la aorta de ratón RhoA cKO. Descubrimos que, independientemente del tratamiento con AngII, la reducción del diámetro del gel de colágeno que contenía VSMC RhoA cKO se vio significativamente afectada, en comparación con la del gel que contenía VSMC de control (Fig. 3b, c). Estos resultados indican que las VSMC de RhoA cKO tienen menos contractilidad que las VSMC de control.

a Cambios en la tensión del anillo aórtico medidos con un miógrafo de alambre. n = 6, cada grupo. b Ensayo de contractilidad en gel de colágeno in vitro utilizando VSMC aórticas de ratón aisladas mediante tratamiento con solución salina o AngII. c Gráfico de resumen del diámetro del gel de colágeno que contiene VSMC examinado en (b). n = 7–10, cada grupo. d Inmunotinción de α-SMA en la aorta de ratón después del tratamiento de 4 semanas. e Imágenes de inmunofluorescencia de VSMC aórticas teñidas con el anticuerpo α-SMA después del tratamiento con solución salina o AngII durante 24 h. La actina F y los núcleos se visualizaron con faloidina y DAPI, respectivamente, en ( d, e ). f Western blot de α-SMA en VSMC aórticas después del tratamiento con solución salina o AngII durante 24 h. Se transfirió GAPDH para el control de carga. g Gráfico resumen de la relación α-SMA/GAPDH examinada en (f). n = 6, cada grupo. h Análisis qPCR de genes relacionados con el fenotipo contráctil de VSMC. Las VSMC aórticas se trataron con solución salina o AngII durante 24 h. n = 8, cada grupo. Barras de escala: 2 mm (b), 20 μm (d) y 50 μm (e). Se aplicó ANOVA bidireccional (a, c) o unidireccional (g, h) para comparar los datos entre grupos. *p < 0.05, **p < 0.01 y ***p < 0.001 vs. Control en el mismo tratamiento; †††p < 0,001 vs. Control en el tratamiento salino.

Luego, verificamos el control y las aortas y VSMC de RhoA cKO mediante el examen de marcadores para la estructura contráctil de VSMC, como α-SMA6. Los análisis de inmunofluorescencia y transferencia Western mostraron que la expresión de α-SMA disminuyó en la aorta RhoA cKO y las VSMC, en comparación con las de control (Fig. 3d-g). Además, se observó una expresión reducida y desorganizada de actina F en respuesta a la pérdida de RhoA en la aorta y las VSMC (Fig. 3d, e). La expresión reducida de α-SMA y el deterioro de la actina F también se encontraron en el área AAA de la aorta de control (Fig. 3b complementaria). qPCR reveló una expresión significativamente reducida de otros genes marcadores contráctiles, Mylk y Myh11, así como Acta2, en RhoA cKO VSMC en comparación con los VSMC de control (Fig. 3h). Además, realizamos los experimentos de rescate para confirmar que las expresiones reducidas de α-SMA y otros genes marcadores contráctiles de VSMC dependían específicamente de la pérdida de RhoA en VSMC. Cuando GFP-RhoA-wild-type (WT) se volvió a expresar en RhoA cKO VSMC al nivel de las VSMC de control, la expresión de la proteína α-SMA se recuperó por completo y se observó una organización normal de actina F en las células (Fig. 4a–c). De manera similar, la expresión reducida de genes marcadores contráctiles en RhoA cKO VSMC se restauró mediante la reexpresión de GFP-RhoA-WT (Fig. 4d complementaria).

Debido a que la disfunción y la desorganización de la capa media de la aorta generalmente afectan la función de la barrera endotelial y viceversa22,23, examinamos la morfología de la capa endotelial y descubrimos que la capa se interrumpió principalmente en el sitio de AAA en ratones RhoA cKO después de AngII+ Tratamiento BAPN (Fig. 4a). Esta función de barrera endotelial deteriorada en la aorta RhoA cKO se confirmó además por la acumulación de tinte en la pared aórtica. Cuando se inyectó por vía intravenosa el tinte Evans Blue en los ratones, la acumulación de tinte aumentó significativamente en los ratones RhoA cKO tratados con AngII + BAPN (Fig. 4b, c). La interrupción puede permitir que las células inflamatorias se infiltren en la pared aórtica. La tinción de inmunofluorescencia mostró que en la infusión de solución salina, la infiltración de células inflamatorias según lo determinado por los marcadores CD68 y F4/80 fue mínima en las aortas control y RhoA cKO, pero en respuesta al tratamiento con AngII+BAPN, la infiltración aumentó notablemente en la aorta RhoA cKO (Fig. 4d, e). Las citoquinas inflamatorias facilitan la ruptura de la capa endotelial y la infiltración de células inflamatorias24. A continuación, investigamos la expresión de citoquinas inflamatorias y descubrimos que aumentó en la aorta RhoA cKO después de una infusión de reactivos de 4 semanas y en VSMC RhoA cKO aisladas después de la estimulación con AngII (Fig. 4f, g). Además, el aumento en la expresión de citocinas inflamatorias en las VSMC de RhoA cKO se revirtió mediante la transfección de GFP-RhoA-WT en las células (Fig. 4e complementaria). Estos resultados sugieren que la pérdida de RhoA en las VSMC aórticas aumenta la inflamación vascular a través de la regulación positiva de la producción de citocinas.

a Imágenes de inmunofluorescencia del control y aorta de ratón RhoA cKO teñidas con el anticuerpo anti-CD31. La aorta se extrajo después del tratamiento de 4 semanas con solución salina o AngII+BAPN. La actina F y los núcleos se visualizaron con faloidina y DAPI, respectivamente. Una flecha y una punta de flecha indican pérdida de endotelio e infiltración de células inflamatorias, respectivamente. b Ensayo de permeabilidad vascular para evaluar la función de barrera endotelial en la aorta. Diez minutos después de la inyección intravenosa de colorante Evans Blue, se extrajo la aorta de los ratones tratados con solución salina o AngII+BAPN y se midió la acumulación de colorante. c Gráfico de resumen de la intensidad media de la acumulación de colorante azul de Evans. n = 5, cada grupo. d Imágenes de inmunofluorescencia del control y aorta de ratón RhoA cKO teñidas con el anticuerpo CD68 o F4/80. La aorta se extrajo como se describe en (a). e Gráfico resumen del porcentaje de área positiva para CD68 o área positiva para F4/80 en la media de la aorta. n = 3–7, cada grupo. f, g Gráficos de resultados de qPCR para citoquinas inflamatorias en la aorta de ratón (f) y VSMC aórticas (g). La aorta se extrajo como se describe en (a) y las VSMC se trataron con solución salina o AngII durante 24 h. n = 3–6, cada grupo. Barras de escala: 30 μm (a, d) y 1 mm (b). En (c, e, f, g), se aplicó ANOVA unidireccional para comparar los datos entre grupos. *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 vs. Control en el mismo tratamiento. †p < 0,05, ††p < 0,01 y †††p < 0,001 frente a RhoA cKO en el tratamiento salino.

Para investigar más a fondo los mecanismos potenciales para el aumento de la destrucción de elastina en la aorta RhoA cKO, examinamos las expresiones de MMP2 y MMP9, que son proteinasas clave en la destrucción de proteínas de la matriz extracelular (ECM). El nivel de ARNm de Mmp2 en VSMC cultivadas estimuladas con AngII fue significativamente más alto en RhoA cKO que en el control (Fig. 5a complementaria). La inmunotinción mostró que la expresión de MMP2 en la aorta aumentó en ratones RhoA cKO, en comparación con los ratones de control, después del tratamiento con AngII y BAPN (Figuras complementarias 5b, c). Se obtuvieron resultados similares para la expresión de MMP9 (Fig. 5a, d, e complementarias). Por el contrario, las expresiones del inhibidor tisular de la metaloproteinasa 1 (TIMP1) y TIMP2, que son inhibidores endógenos de las MMP, se redujeron notablemente en VSMC cultivadas y aorta de ratones RhoA cKO (Fig. 5f-j complementaria), lo que sugiere que ambos aumentaron las MMP. La expresión y su actividad mejorada a partir de la expresión reducida de TIMP contribuyen de manera cooperativa a la degradación robusta de ECM para la formación de AAA en la aorta de ratones RhoA cKO. La zimografía con muestras de tejido aórtico humano también detectó cantidades más altas de MMP2 y MMP9 pro y maduras en la lesión AAA que en el área normal (Fig. 5k, l complementaria). Estos datos indican que RhoA inhibe la expresión y activación de las MMP, lo que da como resultado menos anomalías de la MEC en la aorta de los ratones de control después de la estimulación farmacológica.

A continuación, buscamos investigar la vía de señalización responsable de la inflamación y la expresión de MMP en las VSMC de la aorta. Estudios previos han demostrado que los factores de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAP), como la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) y p38, regulan los fenómenos anteriores25,26. Por lo tanto, examinamos la actividad (nivel de fosforilación) de ERK1/2 y p38. La señal de inmunofluorescencia de ERK1 / 2 y p38 fosforilados aumentó en la aorta RhoA cKO, en comparación con la aorta de control, después del tratamiento de 4 semanas con AngII + BAPN (Fig. 5a-d). Este aumento también se observó en VSMC estimuladas con AngII (Fig. 5e, f). Para explorar más a fondo la molécula que regula la actividad de las MAP quinasas, nos centramos en MAP4K427,28, que también está relacionada con la inflamación vascular y la contractilidad de los cardiomiocitos29,30. La activación (fosforilación) inducida por estimulación farmacológica de MAP4K4 fue significativamente mayor en la aorta y las VSMC aisladas de ratones RhoA cKO que en los ratones de control (Fig. 5g-j). Además, la mejora inducida por AngII de la vía de señalización de la MAP quinasa en las VSMC de RhoA cKO se devolvió al nivel en las VSMC de control mediante la reexpresión de GFP-RhoA-WT (Figura complementaria 4f, g). La especificidad de los anticuerpos para la inmunotinción de ERK1/2, p38 y MAP4K4 fosforilados se validó mediante experimentos utilizando las aortas RhoA cKO después de la administración del inhibidor. Las señales para ERK1/2, p38 y MAP4K4 fosforilados, que se detectaron claramente mediante el tratamiento con AngII + BAPN, desaparecieron en presencia del inhibidor de cada molécula de señalización de MAP quinasa (Fig. 6 complementaria). En la aorta humana, la activación de MAP4K4 aumentó en la lesión AAA, en comparación con el área normal (Fig. 5k-n), e incluso en ratones de control, también se observó la activación mejorada en el sitio de AAA (Fig. 3d complementaria). , e). Estos resultados sugieren que RhoA en VSMC puede atenuar la cascada de señalización de MAP quinasa para prevenir la formación de AAA.

a, c, g, k Imágenes de inmunofluorescencia de control y aorta de ratón RhoA cKO después del tratamiento de 4 semanas con AngII+BAPN (a, c, g) y de áreas normales y AAA en aorta humana (k). La actina F y los núcleos se visualizaron con faloidina y DAPI, respectivamente. b, d, h, l Gráfico de resumen del porcentaje de área positiva para cada molécula de señalización de MAP quinasa. n = 9 en Control y n = 10 en RhoA cKO (b), n = 8 en Control y n = 10 en RhoA cKO (d), y n = 5, cada grupo (h, l). e, i Western blot con los anticuerpos indicados usando VSMC aórticas cultivadas después del tratamiento con solución salina o AngII durante 24 h. GAPDH sirvió como control de carga. f, j Gráfico de resumen de la proporción de moléculas de señalización de MAP quinasa fosforiladas/totales en cada grupo. n = 3–5, cada grupo. m Western blot para P-MAP4K4 y MAP4K4 total en áreas normales y AAA en aorta humana. n Gráfico resumen del ratio P-MAP4K4/MAP4K4. n = 4, cada grupo. Barras de escala: 20 μm (a, c, g, k). En (b, d, h, l, n), los datos entre los dos grupos se analizaron mediante la prueba t, y en (f, j), se aplicó ANOVA unidireccional para comparar los datos entre grupos. *p < 0,05 y ***p < 0,001 frente a control o normal; †p < 0,05 y †††p < 0,001 vs RhoA cKO en el tratamiento salino.

Además, evaluamos la importancia de la actividad de MAP4K4 para la formación de AAA en ausencia de VSMC RhoA utilizando el inhibidor de MAP4K4 DMX-5804. La formación de AAA se redujo significativamente mediante el tratamiento intravenoso con DMX-5804 además de AngII y BAPN en ratones RhoA cKO, sin cambios en la hemodinámica (Tabla 2, Fig. 6a y Fig. 7a complementaria). Los análisis histológicos mostraron que el tratamiento con DMX-5804 revirtió la morfología adversa y la degradación de la aorta RhoA cKO similar a la aorta de control tratada con DMX-5804 (Fig. 6b-d). También se confirmó que el tratamiento con DMX-5804 no afectó las funciones cardíacas y los volúmenes de plasma en ratones RhoA cKO ni en ratones de control (Fig. 7b, c complementarias). Además, descubrimos que la tensión aórtica de los ratones RhoA cKO se recuperó mediante la inhibición de MAP4K4 con DMX-5804 (Fig. 6e). El ensayo de contractilidad en gel de colágeno usando VSMC aisladas también mostró resultados similares (Fig. 6f), y DMX-5804 revirtió las anomalías morfológicas con expresión reducida de α-SMA y alteración de la organización de actina F en VSMC tratadas con AngII (Fig. 6g).

a Aspecto externo de la aorta con el corazón y los riñones extraídos después del tratamiento de 4 semanas con AngII y BAPN en presencia de DMSO al 0,5 % (Vehículo) o DMX-5804 (DMX). Una flecha indica AAA formado. b Tinción HE de la aorta. c Tinción de Verhoeff Van Gieson de la aorta. d Gráfico resumen del grado de degradación de la elastina analizado en (c). n = 7–11, cada grupo. e Cambios en la tensión del anillo aórtico medidos con miógrafo de alambre. n = 10 en AngII+BAPN + Vehículo y n = 6 en AngII+BAPN + DMX. f Cambios en el diámetro del gel de colágeno que contiene VSMC aórticas en el ensayo de contractilidad del gel de colágeno in vitro. n = 10 en AngII+Vehículo y n = 8 en AngII+DMX. g Imágenes de inmunofluorescencia de VSMC aórticas teñidas con el anticuerpo α-SMA después del tratamiento con AngII en presencia de vehículo o DMX-5804 durante 24 h. La actina F y los núcleos se visualizaron con faloidina y DAPI, respectivamente. h, j Western blot con los anticuerpos indicados usando VSMC aórticas después del tratamiento con o sin AngII o DMX-5804 durante 24 h. GAPDH sirvió como control de carga. i, k Gráficos de resumen de las relaciones P-MLC2/MLC2, P-MYLK/MYLK y MYLK/GAPDH. n = 4 (i), n = 3–4 (k), cada grupo. l Experimentos de inmunoprecipitación utilizando los anticuerpos indicados. Se usó IgG como control negativo para la inmunoprecipitación. m Análisis qPCR utilizando VSMC tratadas con o sin AngII y/o DMX-5804 durante 24 h. n = 4–5, cada grupo. Barras de escala: 500 μm (b, c) y 20 μm (g). Se aplicó ANOVA unidireccional (d, i, k, m) o bidireccional (e, f) para comparar los datos entre grupos. *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001 vs. Vehículo o Control; ††p < 0,01 y †††p < 0,001 frente al tratamiento con AngII sin DMX-5804; §p < 0,05 vs. Sin tratamiento.

Dado que la contractilidad de VSMC depende críticamente del nivel de fosforilación de la cadena ligera de miosina 2 (MLC2), por lo tanto, examinamos el nivel en VSMC mediante transferencia Western. Después de la estimulación con AngII, la MLC2 fosforilada aumentó en las VSMC de control, pero no se detectó ningún aumento en las VSMC de RhoA cKO; el tratamiento de RhoA cKO VSMC con DMX-5804 restauró el nivel de fosforilación de MLC2 similar al de los VSMC de control (Fig. 6h, i). La fosforilación de MLC2 está regulada por el equilibrio de la función de dos enzimas: la quinasa de cadena ligera de miosina (MYLK), que induce la fosforilación de MLC2, y la fosfatasa de cadena ligera de miosina (MLCP), que desfosforila MLC2 y es fuertemente inhibida por ROCK31,32. . En RhoA cKO VSMC, se redujo la expresión de MYLK, lo que estaba en línea con los resultados de ARNm en la Fig. 3h, y MYLK fosforilada (la forma inactivada de MYLK) aumentó incluso con la expresión reducida de MYLK (Fig. 6j, k). La fosforilación mejorada de MYLK por pérdida de RhoA fue bloqueada por tratamiento con DMX-5804. Además, los ensayos de inmunoprecipitación mostraron que MAP4K4 interactuaba con MYLK (Fig. 6l). Estos resultados sugieren que MAP4K4 fosforila e inactiva MYLK, lo que conduce a la inhibición de la fosforilación de MLC2. Además, observamos que la expresión reducida de Myh11 y Acta2 en RhoA cKO VSMC se recuperó mediante el tratamiento con DMX-5804 (Fig. 6m). Juntos, estos datos indican la participación de MAP4K4 en la regulación de la contractilidad de VSMC.

El efecto inhibidor de DMX-5804 sobre la inflamación y la señalización de MAP quinasa se examinó en muestras de aorta de ratón y VSMC. El tratamiento adicional con DMX-5804 disminuyó significativamente los niveles de expresión de F4/80 y MMP2, así como la fosforilación de MAP4K4 en la aorta del ratón RhoA cKO (Figuras complementarias 8a, b). El análisis de transferencia Western mostró que la inhibición de MAP4K4 con DMX-5804 en VSMC disminuyó la activación inducida por AngII de la señalización de p38 y ERK1 / 2 que está asociada con la inflamación vascular y la degradación de ECM (Fig. 8c, d complementaria). De hecho, el aumento de la expresión de citoquinas inflamatorias en VSMC RhoA cKO después del tratamiento con AngII fue significativamente suprimido por DMX-5804 (Fig. 8e complementaria), y los cambios mediados por AngII de la expresión de MMP y TIMP en RhoA cKO VSMC fueron completamente cancelados por DMX-5804 (Fig. 8f complementaria). Juntos, estos resultados indican que la inhibición de MAP4K4 en VSMC que carecen de RhoA suprime la formación de AAA, rescata la contractilidad de las VSMC y atenúa la inflamación vascular y la degradación de la MEC mediante la inactivación de la señalización de la MAP quinasa.

Para explorar el mecanismo molecular por el cual RhoA modula la actividad de MAP4K4 en VSMC, realizamos inmunoprecipitación y espectrometría de masas (MS). Las VSMC RhoA cKO transfectadas con GFP-RhoA-wild-type (WT) o el vector de control GFP se estimularon con AngII y, luego, los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-GFP, seguido de la detección de inmunoprecipitantes en Coomassie Brilliant Blue (CBB ) tinción (Fig. 7a). Las proteínas que co-inmunoprecipitaron con GFP-RhoA-WT, pero no con GFP, se analizaron mediante cromatografía líquida (LC)-MS/MS. El análisis identificó 1453 péptidos que pertenecían a 359 proteínas (Datos complementarios 1). Recientemente, se ha informado que la actividad de MAP4K4 está regulada por el complejo de fosfatasa y quinasa que interactúan con la estriatina (STRIPAK), que está aguas abajo de RhoA33,34. Con base en este informe, realizamos un análisis in silico de las 359 proteínas para identificar la proteína que puede interactuar preferentemente con un componente del complejo STRIPAK. Descubrimos que Set (número de acceso Q9EQU5) tenía la puntuación más alta en la unión a la proteína fosfatasa 2A (PP2A), un componente de STRIPAK que regula negativamente la actividad de MAP4K4 al reducir la fosforilación de MAP4K4. Estudios previos también demostraron que Set se asocia con PP2A e inhibe su actividad fosfatasa35,36, y que regula la señalización de Rac1, otra GTPasa de la familia Rho37.

a Después de la transfección del plásmido de expresión GFP o GFP-RhoA-WT, las VSMC se estimularon con AngII durante 24 h. Los extractos celulares se inmunoprecipitaron e inmunotransfirieron con el anticuerpo anti-GFP (panel superior), y las proteínas inmunoprecipitadas para el anticuerpo anti-GFP se detectaron mediante tinción con Coomassie Brilliant Blue (CBB) (panel inferior). Estrella única y estrellas dobles: cadenas pesadas y ligeras de IgG, respectivamente. Flechas: GFP transfectada o GFP-RhoA-WT. Las bandas rodeadas por rectángulos de puntos rojos se analizaron más mediante LC-MS/MS. b Transferencia de Western para P-MAP4K4 y MAP4K4 en VSMC aórticas RhoA cKO transfectadas con siRNA codificado o siSet. c Gráfico resumen de la relación P-MAP4K4/MAP4K4. d Los extractos celulares de las VSMC de control después del tratamiento con solución salina o AngII se usaron en ensayos desplegables con proteína de fusión GST, incluido el dominio de unión a RhoA unido a GTP de mDia, seguido de transferencia de Western con anticuerpo anti-Set o anti-RhoA. e Después de la estimulación de las VSMC de control o RhoA cKO con AngII durante 24 h, los extractos celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-PP2A o IgG de control, seguido de transferencia Western con los anticuerpos indicados. f Imágenes de inmunofluorescencia de VSMC de control o RhoA cKO teñidas con los anticuerpos indicados después del tratamiento con AngII durante 24 h. Los núcleos se visualizaron con DAPI. Barras de escala: 20 μm. g, j Después de la transfección de células con siRNA scramble o siSet y estimulación con AngII durante 24 h, los extractos celulares de control o RhoA cKO VSMC se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. h, k Gráficos de resumen de las proporciones de moléculas de señalización de MAP quinasa fosforiladas/totales (h) y P-MLC2/MLC2, P-MYLK/MYLK y MYLK/GAPDH (k). n = 3 (h) y n = 4–5 (k), cada grupo. i Gráfico de resumen del ensayo de contractilidad en gel de colágeno in vitro que contiene VSMC usando VSMC RhoA cKO estimuladas con AngII transfectadas con siRNA scramble o siSet. n = 8, cada grupo. Los datos se analizaron mediante la prueba t (c), ANOVA unidireccional (h, k) o ANOVA bidireccional (i) para comparar los grupos. En (c), ***p < 0,001 frente a Scramble; en (h, k), **p < 0,01 y ***p < 0,001 frente a Control, ††p < 0,01 y †††p < 0,001 frente a Scramble; en (i), *p < 0,05 frente a Scramble.

A continuación, para determinar si Set realmente contribuye a la regulación de la actividad de MAP4K4, realizamos experimentos de eliminación en RhoA cKO VSMC con estimulación AngII, y descubrimos que la transfección de siRNA de Set redujo significativamente la fosforilación de MAP4K4 (Fig. 7b, c). Luego, planteamos la hipótesis de que, en respuesta a la estimulación de AngII en las VSMC, aumentaría la interacción de Set con RhoA activada inducida por AngII, lo que disocia a Set de PP2A, y que PP2A libre podría unirse a MAP4K4 e inhibir la activación de MAP4K4. De acuerdo con esta hipótesis, la interacción de Set con RhoA unida a GTP aumentó en VSMC después de la estimulación con AngII (Fig. 7d). En las VSMC de control estimuladas con AngII, se observó la asociación de PP2A con MAP4K4, y esta asociación se vio afectada por la pérdida de RhoA debido a la unión de PP2A-Set (Fig. 7e, paneles izquierdos y Fig. 7f), que conduce a la autofosforilación de MAP4K438. Además, cuando Set fue derribado en RhoA cKO VSMC, se restauró la asociación entre PP2A y MAP4K4 (Fig. 7e paneles derechos). Por el contrario, cuando las VSMC de control se transfectaron con la isoforma 1 y la isoforma 2 de Set marcadas con HA (HA-Set1 y HA-Set2) y se estimularon con AngII, la unión de PP2A-Set aumentó y la asociación de PP2A-MAP4K4 disminuyó incluso en presencia de de RhoA (Fig. 9a complementaria), lo que sugiere la interacción molecular equilibrada y funcional entre Set, PP2A y MAP4K4 aguas abajo de RhoA.

Finalmente, confirmamos que la regulación mediada por Set de la activación de MAP4K4 estuvo involucrada en la activación de MAP quinasas y la contractilidad de VSMC aguas abajo de MAP4K4. Bajo la estimulación de AngII, la fosforilación de ERK1/2 y p38, así como de MAP4K4, no aumentó en las VSMC de RhoA cKO mediante la eliminación adicional de Set (Fig. 7g, h). De manera consistente, se conservó la contractilidad de las VSMC, se restauró la fosforilación de MLC2 y la fosforilación de MYLK no aumentó en las VSMC RhoA cKO con transfección siSet (Fig. 7i-k). En las VSMC de control estimuladas con AngII transfectadas con HA-Set1 y HA-Set2, las MAP4K4, ERK1/2 y p38 fosforiladas aumentaron significativamente, en comparación con las VSMC transfectadas con un plásmido vacío (Fig. 9b, c complementarias). Además, la sobreexpresión de HA-Set1 y HA-Set2 suprimió la fosforilación de MLC2 y facilitó la inactivación (fosforilación) de MYLK (Figura complementaria 9d, e), que puede resultar de la mayor activación de MAP4K4 por el abundante Set- disociación mediada de MAP4K4 de PP2A. En conjunto, estos resultados sugieren que RhoA regula negativamente la activación de MAP4K4 a través de Set y PP2A, lo que da como resultado el mantenimiento de la contractilidad y la morfología de las VSMC y la aorta.

En este estudio, identificamos los efectos protectores de RhoA en VSMC en la formación de AAA utilizando tejidos aórticos humanos, un modelo de ratón RhoA cKO y enfoques in vitro. La pérdida de RhoA está implicada tanto en la disfunción de la contractilidad de las VSMC como en el aumento de la inflamación vascular. Estas conclusiones se basan en los siguientes hallazgos: (1) la expresión de RhoA se redujo notablemente en lesiones AAA humanas, (2) la formación de AAA aumentó en ratones RhoA cKO tratados con AngII y BAPN, (3) se redujo la expresión génica relacionada con la contractilidad de VSMC por la pérdida de RhoA, y se indujo la contractilidad disminuida de VSMC con la expresión de citocinas inflamatorias, (4) la infiltración de células inflamatorias y la disfunción endotelial aumentaron en la aorta de ratón RhoA cKO, (5) el agotamiento de RhoA indujo la degradación de ECM según lo determinado por el aumento de la actividad de las MMP y la disminución la actividad de TIMP, y (6) la cascada de MAP quinasa mediada por MAP4K4 se activó en aorta nula RhoA y VSMC.

Aunque varios reportes demostraron la implicación de los reguladores de RhoA, como GAP o GDP estimulador de la disociación de RhoA, en aneurismas de aorta torácica cuyas características son diferentes a AAA39,40, RhoA en sí misma no ha sido certificada como molécula predisponente para prevenir AAA, que se revela en este estudio. También encontramos que RhoA en VSMC era importante para la expresión de genes de generación de fuerza, como Acta2 y Myh11, y la supresión de la transcripción de genes de citocinas/quimiocinas, como Il1b y Ccl2. Por lo tanto, el agotamiento de RhoA en las VSMC promovió la expresión de dichas citocinas/quimiocinas y recluta células inflamatorias en la media de la aorta, además de la contractilidad reducida de las VSMC. Las células inflamatorias acumuladas en la pared aórtica también producen abundantes MMP y potencian su activación, lo que lleva a la vulnerabilidad de la pared41. Estos fenómenos pueden contribuir críticamente a la inducción de AAA.

MAP4K4 en células endoteliales promueve la inflamación vascular30. MAP4K4 actúa como un regulador corriente arriba de la vía de señalización de la MAP quinasa, y el agotamiento de MAP4K4 suprime la vía y la inflamación27,42. En este estudio, identificamos la asociación entre RhoA y MAP4K4 en VSMC y descubrimos que esta asociación es importante para la prevención de AAA. En presencia de RhoA, las actividades de MAP4K4 y MAP quinasas se inhibieron, incluso después de la estimulación con AngII, lo que resultó en la reducción de la inflamación. Por el contrario, en ausencia de RhoA en las VSMC, la actividad de MAP4K4 aumentó y la incidencia de formación de AAA aumentó significativamente. Cuando la actividad de MAP4K4 fue atenuada por DMX-5804 en ratones RhoA cKO y VSMC sin RhoA, no solo se recuperó claramente la respuesta inflamatoria mediada por MAP4K4, sino también la contractilidad vascular al inducir la actividad de MYLK y MLC2, así como la expresión de Acta2 y Myh11. Además, la formación de AAA inducida por la pérdida de RhoA fue completamente inhibida por el tratamiento con DMX-5804. Esto muestra que RhoA transduce la señal a MAP4K4 para inhibir su actividad y que la inhibición tiene un efecto protector sobre la formación de AAA, lo que sugiere que MAP4K4 puede representar un objetivo terapéutico contra AAA.

Otro hallazgo de nuestro estudio es la identificación de una molécula de señalización que une RhoA y STRIPAK, un complejo molecular que modula la actividad de MAP4K4. Un estudio anterior mostró que la RhoA unida a GTP activo suprimió la activación (fosforilación) de MAP4K4 a través de PP2A, una fosfatasa en el complejo STRIPAK34. Sin embargo, se desconoce cómo RhoA regula la función PP2A. Realizamos un ensayo desplegable y LC-MS/MS usando VSMC estimuladas con AngII para identificar la(s) molécula(s) que se asocia(n) con RhoA y PP2A. Mediante el análisis in silico posterior a LC-MS/MS, se encontró que Set era un candidato para la asociación. Además, confirmamos la asociación molecular por inmunoprecipitación y descubrimos que la RhoA activada se unía preferentemente a Set, lo que disocia a Set de PP2A. Debido a que Set es un supresor de PP2A35,36, la disociación de Set de PP2A induce la activación de PP2A y la posterior inhibición de MAP4K4. Por el contrario, la eliminación de Set en RhoA cKO VSMC canceló el aumento en la fosforilación de MAP4K4 y sus MAP quinasas aguas abajo, y restauró la contractilidad de las VSMC en presencia de tratamiento con AngII. Estos resultados indican que Set podría representar otra diana terapéutica contra AAA. En conclusión, nuestros hallazgos de este estudio se resumen esquemáticamente en la Fig. 10 complementaria.

Aunque la investigación sobre el AAA continúa aumentando, los tratamientos para esta devastadora enfermedad vascular aún son limitados43,44. El AAA es una enfermedad vascular progresiva potencialmente mortal que se desarrolla de forma silenciosa y que a menudo provoca la muerte súbita por rotura aórtica. Por lo tanto, el diagnóstico precoz y el descubrimiento de nuevos tratamientos son necesarios para inhibir el desarrollo de la formación de AAA. Estudios previos han demostrado que los trastornos genéticos en las VSMC juegan un papel crucial en AAA2. En este sentido, el presente estudio se suma a la comprensión actual de la patología AAA, mostrando que RhoA regula las proteínas de generación de fuerza para mantener la contractilidad aórtica e inhibe la inflamación vascular, que están mediadas por MAP4K4. Aunque se necesitan más estudios, especulamos que RhoA puede ser un biomarcador de diagnóstico para AAA y el mantenimiento de su expresión en VSMC de la aorta es importante para contrarrestar la formación de AAA y el pronóstico de esta enfermedad.

Una de las limitaciones de este estudio podría ser que la formación de AAA fue inducida por la estimulación farmacológica de AngII y BAPN en ratones RhoA cKO, mientras que el AAA humano generalmente se forma como resultado de la hipertensión y la pared aórtica mediadas por el envejecimiento y/o la aterosclerosis. vulnerabilidad45,46. En la condición basal, no pudimos encontrar diferencias entre los ratones control y RhoA cKO. Podría existir la posibilidad de que el aumento de la expresión de otros miembros de la familia Rho, como RhoB, compense la pérdida de RhoA en la capa media de la aorta para mantener la estructura aórtica normal. Dado que la administración de AngII y BAPN a menudo se usa para generar el modelo animal de AAA47,48, la utilización de estos reactivos podría ser aceptable para la investigación de la función de la molécula diana, como RhoA, en el proceso y mecanismo de formación de AAA. Podría ser interesante examinar más a fondo si la formación de AAA se acelera con el envejecimiento en ratones RhoA cKO. Debido a que lleva demasiado tiempo y está fuera del alcance de este estudio, sería un plan de investigación experimental futuro.

En conclusión, demostramos con éxito que VSMC RhoA contrarrestó la formación de AAA en el modelo de ratón cKO y reveló el mecanismo por el cual RhoA suprimió la actividad de MAP4K4 a través de Set para prevenir AAA. En cuanto a las implicaciones traslacionales y clínicas, un inhibidor de MAP4K4 DMX-5804 revirtió los fenómenos adversos para la formación de AAA inducidos por la pérdida de RhoA en VSMC, proporcionando un potencial terapéutico de este inhibidor para AAA en el que la expresión de RhoA y la actividad de MAP4K4 se redujeron notablemente. Este es un hallazgo valioso porque actualmente no existe un tratamiento farmacológico efectivo para el AAA.

Todos los protocolos que utilizan muestras de aorta humana fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad de Ciencias Médicas de Shiga y se ajustan a los principios descritos en la Declaración de Helsinki. Los tejidos aórticos se obtuvieron de pacientes con AAA después de la cirugía. Las características clínicas de los pacientes se resumieron en la Tabla complementaria 1. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de tejidos aórticos para este estudio.

Generamos ratones RhoA-floxed por recombinación homóloga del alelo RhoA en células madre embrionarias (ES). El vector diana contenía el exón 3 del gen RhoA flanqueado por sitios loxP y el gen neo. Las células ES se transfectaron con el vector y se seleccionaron mediante tratamiento con G418. El gen neo se eliminó mediante la administración transitoria de Cre recombinasa. Se microinyectaron células ES que albergaban el alelo RhoA-floxed sin neo en blastocistos para generar ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se cruzaron adicionalmente con ratones B6D2F1 (CLEA Japón, Tokio, Japón) para obtener ratones heterocigotos para el alelo RhoA-floxed. Los ratones heterocigotos se retrocruzaron al menos seis veces con la cepa C57BL/6, y tanto los ratones heterocigotos macho como hembra se cruzaron para obtener ratones homocigotos para el alelo RhoA-floxed. A continuación, los ratones homocigotos se aparearon con ratones transgénicos que expresaban la recombinasa Cre impulsada por el promotor SM22α (SM22α-Cre) en la cepa C57BL/6, que se adquirieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.). La descendencia con el alelo heterocigoto RhoA-floxed y el gen Cre se apareó de nuevo con los ratones homocigotos RhoA-floxed para generar ratones RhoA cKO específicos de VSMC. Se usaron ratones compañeros de camada sin el gen Cre como control. En este estudio se utilizaron un total de 106 ratones (ratones macho de 10 a 14 semanas de edad. Control n = 47; RhoA cKO n = 59). Los cebadores para el genotipado para detectar ratones con el alelo Cre y RhoA-floxed fueron los siguientes: Cre, Forward 5′-ACCTCTGGGAACTGGTCCTT-3′ y Reverse 5′-AGTTACCCCCAGGCTAAGTGC-3′; RhoA-floxed, Forward 5′-TCTTAACCGCTGAGCCATCT-3′ y Reverse 5′-ACCTCTGGGAACTGGTCCTT-3′.

Para inducir AAA en ratones, se administraron AngII (1000 ng/kg/min) y BAPN (37,5 mg/kg/d) durante 4 semanas utilizando minibombas osmóticas (ALZET modelo 1004; Durect Corp., Cupertino, CA, EE. UU.) como se describió anteriormente con algunas modificaciones49. Los ratones se anestesiaron con isoflurano (1,0-1,5%). Se implantaron dos minibombas llenas de AngII y BAPN disueltas en solución salina estéril, respectivamente, en el espacio subcutáneo a través de una pequeña incisión en la parte posterior del cuello. Se usaron bombas llenas de solución salina únicamente como control. Los sitios de incisión se cerraron con sutura y cicatrizaron rápidamente sin ninguna infección. En algunos ratones, el inhibidor de MAP4K4 DMX-5804 (2,5 mg/kg) disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) al 0,5 % se administró por vía intravenosa a través de la vena de la cola tres veces por semana durante 4 semanas. Los diámetros aórticos y la contractilidad y las dimensiones cardíacas se controlaron bajo anestesia con isoflurano (1,0–1,5 %) mediante ultrasonografía (Vevo 2100; VisualSonics Inc., Toronto, Canadá). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ciencias Médicas de Shiga y se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones relevantes, incluidas las pautas de Informes de investigación animal de experimentos in vivo (ARRIVE).

La PA arterial se midió semanalmente en ratones conscientes utilizando el método de manguito de cola pletismográfico (modelo BP-98-AL; Softron, Tokio, Japón). Los ratones se calentaron durante al menos 5 a 10 minutos a 37 °C en el termostato cilíndrico antes y durante el transcurso de la medición de la PA. La PA se midió en intervalos de 2 minutos, y la media de siete mediciones en estado estacionario se utilizó como PA en cada ratón50.

Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y la aorta se perfundió secuencialmente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría y formalina tamponada con fosfato al 10% a presión fisiológica durante 5 minutos cada vez. Las muestras extraídas de aorta humana y de ratón se fijaron con formalina tamponada con fosfato al 10 % durante 24 h y se incluyeron en parafina. Se prepararon y desparafinaron secciones transversales (4 µm de espesor). Se realizó tinción con HE para detectar la morfología de las aortas. Para la tinción de Verhoeff Van Gieson, las secciones fijadas con formalina y desparafinadas se incubaron con solución de Verhoeff durante 1 h, se contrastaron con solución de Van Gieson, se deshidrataron rápidamente y se montaron en el portaobjetos de vidrio. La degradación de la lámina elástica medial se analizó mediante la clasificación de la degradación (sin degradación, degradación leve, degradación grave y rotura aórtica)51.

La información detallada de los anticuerpos primarios utilizados en este estudio se resumió en la Tabla complementaria 2.

Se seccionaron y desparafinaron muestras de aorta humana incluidas en parafina y fijadas con formalina. Las muestras se sumergieron en una solución de recuperación de antígeno precalentada (1 mmol/l de ácido cítrico, 0,05 % de Tween 20 a pH 6) a 90–100 °C durante 20–30 min y se enfriaron a temperatura ambiente. La actividad de la peroxidasa endógena en todas las secciones se extinguió utilizando peroxidasa de hidrógeno al 3 % y luego las muestras se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 3 % antes de la incubación durante la noche con un anticuerpo anti-RhoA. Después de lavar con PBS, las muestras se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con biotina (dilución 1:200; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de incubación con estreptavidina-peroxidasa (Nacalai Tesque, Kioto, Japón) durante 30 min. El complejo avidina-biotina se detectó con el kit Strep ABC peroxidase (Nacalai Tesque). Las muestras se contrastaron con hematoxilina, seguidas de etapas de deshidratación.

Se fijaron criosecciones de muestras de aorta humana y de ratón, y muestras de corazón adulto de ratón con paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 10 min y, a continuación, se lavaron tres veces con PBS durante 5 min cada vez. Las muestras se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 30 min y se bloquearon con BSA al 3–5 % durante 30 min a temperatura ambiente para evitar tinciones inespecíficas, seguido de incubación con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario marcado con colorante fluorescente (Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 555, dilución 1:200–1000, Thermo Fisher Scientific), rodamina faloidina (dilución 1:600, Thermo Fisher Scientific) y Alexa Fluor 488/647 faloidina (1 :600 dilución, Thermo Fisher Scientific) durante 1 h a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron tres veces con PBS durante 5 min cada vez y luego se incubaron con solución de montaje con DAPI para tinción de núcleos (Dojindo, Kumamoto, Japón). Las imágenes de inmunofluorescencia se tomaron con un microscopio confocal (FV-1000; Olympus, Tokio, Japón, o Leica SP8; Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).

Para la tinción de embriones de ratón, los embriones en E11.5 se fijaron con metanol al 100 % durante la noche a 4 °C. Los corazones se extrajeron y lavaron con metanol al 50 % en PBS que contenía Triton X-100 al 0,5 % (PBST) durante 30 min a 4 °C, seguido de lavado con PBST durante 30 min a 4 °C. Las muestras se bloquearon con leche al 1% en PBST durante 20 min a 4 °C y se incubaron con los anticuerpos primarios para RhoA y cadena pesada de α-miosina (α-MHC) durante 48 h a 4 °C. Luego, se lavaron tres veces con PBST y se incubaron con los anticuerpos secundarios marcados con colorante fluorescente durante 48 h a 4 °C. Finalmente, se lavaron tres veces con PBST y se incubaron con una solución de alcohol bencílico: benzoato de bencilo (2:3) para aclaramiento óptico. Las imágenes de inmunofluorescencia se tomaron con un microscopio confocal Leica SP8.

Para validar la especificidad de los anticuerpos utilizados para la inmunotinción de moléculas de señalización de MAP quinasa fosforiladas (activadas), se administraron los siguientes inhibidores a ratones RhoA cKO después del tratamiento de 4 semanas con AngII y BAPN: PD-98059 para el inhibidor de ERK, SB-203580 para el inhibidor p38 y DMX-5804 para el inhibidor MAP4K4. Cada inhibidor se disolvió en DMSO al 0,5 % y se inyectaron por vía intravenosa 100 µL de la solución de inhibidor (PD-98059: 10 mg/kg, SB-203580: 5 mg/kg y DMX-5804: 2,5 mg/kg) a través de la vena de la cola de ratones RhoA cKO. El disolvente de DMSO al 0,5 % se inyectó por vía intravenosa a otros ratones como vehículo. 30 minutos después de la inyección, se recogió la aorta y las secciones congeladas se prepararon para la inmunotinción.

El ARN total se aisló de aortas humanas y de ratón y de VSMC de ratón utilizando el reactivo de aislamiento de ARN TRIzol (Thermo Fisher Scientific). El cDNA fue sintetizado por ReverTra Ace qPCR RT Master Mix con gDNA Remover (Toyobo, Osaka, Japón). Después de la transcripción inversa, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el instrumento LightCycler (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza). Los datos de PCR en tiempo real se cuantificaron mediante el método de curva estándar y el nivel de expresión de ARNm de GAPDH humano o de ratón sirvió como control interno. Los cebadores se muestran en la Tabla complementaria 3.

El plásmido de expresión de RhoA-WT marcado con EGFP se preparó previamente52. Los ADNc de la isoforma 1 (Set1) y la isoforma 2 (Set2) de Set de ratón se obtuvieron mediante PCR de transcripción inversa utilizando ARN extraído de VSMC aórticas de ratón. Los cebadores para amplificar los ADNc fueron los siguientes: Set1, Forward 5′-GGGGAATTCGCCCCGAAGCGGCAGTCTGCGAT-3′ y Reverse 5′-GGGCTCGAGCTAATCATCCTCGCCTTCGTCCTCCT-3′; Set2, Adelante 5′-GGGGAATTCTCTGCGCCGACGGCCAAAGCCAG-3′ y Reversa 5′-GGGCTCGAGCTAATCATCCTCGCCTTCGTCCTCCT-3′. Cada ADNc se subclonó en el plásmido de expresión pCMV-HA (Takara Bio, Kusatsu, Japón) al digerirlos con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI y ligarlos con Ligation High Ver.2 (Toyobo, Osaka, Japón). Las secuencias de cDNA insertadas en el plásmido fueron confirmadas por Prism 3100xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.).

Aortas humanas y de ratón, y corazones de ratón se homogeneizaron mecánicamente en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (50 mmol/L de Tris-HCl [pH 7,5], 150 mmol/L de NaCl, 0,5 % de desoxicolato de sodio, 0,1 % de dodecilsulfato de sodio (SDS) , Nonidet P-40 al 1 %, aprotinina 1 μg/mL, leupeptina 1 μg/mL, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mmol/L, fluoruro de sodio 5 mmol/L y ortovanadato de sodio 1 mmol/L). Las VSMC también se lisaron en tampón RIPA. Los lisados ​​se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 min y el sobrenadante se utilizó para otros experimentos. Las muestras de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Luego, la membrana se bloqueó durante 1 h a temperatura ambiente en BSA al 5 % o leche descremada al 5 % en solución salina tamponada con Tris con Tween 20. La membrana se incubó con el anticuerpo primario durante la noche en leche descremada al 5 % a 4 °C, seguido de incubación. con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) durante 1 hora en leche descremada al 5 %. La membrana se incubó con sustrato HRP (Luminata Forte, Millipore Corp., Billerica, MA, EE. UU.) durante 5 min y se observó en un analizador de imágenes luminiscentes LAS-4000 (Fujifilm Life Science, Tokio, Japón). Las densidades de banda se analizaron utilizando el software ImageJ.

Se pulverizaron muestras aórticas congeladas instantáneamente de ratones control y RhoA cKO y se lavaron una vez con PBS durante 30 minutos a 4 °C. Se transfirió una alícuota de la muestra a un tubo nuevo sin digestión con pepsina para determinar el contenido total de colágeno para evaluar la síntesis de colágeno. Después de centrifugar a 16.000 × g durante 30 min a 4 ˚C, las muestras precipitadas se digirieron en 0,5 mol/L de ácido acético que contenía 1 mg/mL de pepsina durante 16 h a 4 ˚C con rotación suave. Las muestras no digeridas se ensamblaron mediante centrifugación a 16 000 × g durante 30 min a 4 °C y se recolectaron como colágeno entrecruzado. El sobrenadante se recogió como colágeno no reticulado y posteriormente se precipitó en 2 mol/L de NaCl durante 30 min, seguido de centrifugación a 16 000 × g durante 30 min a 4 °C. Los colágenos totales, entrecruzados y no entrecruzados se cuantificaron mediante el ensayo de hidroxiprolina53, que se realizó con el kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los resultados se informan como microgramos de hidroxiprolina por miligramo de peso de tejido húmedo.

Para aislar las VSMC aórticas primarias de ratón, se extrajo toda la aorta de los ratones RhoA cKO y de control, se cortó en trozos pequeños y se incubó con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía colagenasa tipo I (Sigma-Aldrich), elastasa (Sigma-Aldrich) e inhibidor de tripsina (Thermo Fisher Scientific) durante 3-4 h a 37 °C en una atmósfera húmeda de 5 % de CO2 y 95 % de aire54. Las VSMC se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10 %. Se usaron VSMC de los pasajes 4 a 7 con una confluencia del 70 % al 80 % para los experimentos. Las características de las poblaciones de VSMC se confirmaron mediante tinción inmunofluorescente para α-SMA (Santa Cruz Biotechnology). Para los experimentos in vitro, las células se trataron con solución salina, 1 µmol/L de AngII y/o 10 µmol/L de DMX-5804 (Selleck, Houston, TX, EE. UU.).

El ADN del plásmido se introdujo en las VSMC mediante el sistema de transfección de neón (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Después de lavar las células con PBS, las células (1 × 107 células/100 μL) se resuspendieron en Buffer R y se mezclaron con 500 ng de cada plásmido. Los parámetros de introducción del plásmido fueron los siguientes: voltaje de pulso 1200 V, ancho de pulso 20 ms y número de pulso 2.

La aorta de ratón aislada se cortó en rodajas redondas (~2 mm de ancho) y se montó en el cable de un miógrafo (Multi Wire Myograph System-Model 620 M; Danish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca) en un baño lleno de agua de Krebs. solución (118 mmol/L NaCl, 25 mmol/L NaHCO3, 11 mmol/L glucosa, 4,7 mmol/L KCl, 1,17 mmol/L MgSO4, 1,2 mmol/L KH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2 a 37 °C), continuamente burbujeado con 95% O2 y 5% CO2. La aorta se equilibró al estado de reposo durante 5 min en la condición. La tensión aórtica del ratón se midió usando el Multi Wire Myograph System55. Las presiones obtenidas se monitorearon y registraron utilizando el software LabChart 8 (ADInstruments Inc., Colorado Springs, CO, EE. UU.).

Solución de colágeno tipo I derivada de tendón porcino (Nitta Gelatin, Osaka, Japón), DMEM (dos veces concentrado), tampón de reconstitución (50 mmol/L NaOH, 260 mmol/L NaHCO3, 200 mmol/L HEPES) y VSMC suspendidas en DMEM se mezclaron en hielo en una proporción de 7:2:1:1. A continuación, se colocó una gota (30–50 μL) de la solución mixta (4 × 105 células/mL) sobre un cubreobjetos siliconizado en una placa de 6 pocillos. La placa se incubó a 37 °C durante 30 min para endurecer el gel y se añadieron al gel 2 mL de DMEM que contenía FBS al 10 % con AngII (concentración final 10 μmol/L) o solución salina. Las células se cultivaron durante 24 h a 37 °C en una atmósfera húmeda de 5 % de CO2 y 95 % de aire. Después del cultivo, se retiró el medio de cada pocillo y se separó cuidadosamente el gel del pocillo. Luego, se midió el diámetro del gel a las 0, 6, 12, 24 y 48 h para medir la contractilidad de las VSMC56 aisladas.

La permeabilidad vascular asociada a la función de barrera endotelial en la aorta se determinó mediante el procedimiento con colorante Evans Blue57. Se inyectaron por vía intravenosa a ratones 100 µl de colorante azul de Evans al 1% (Nacalai Tesque) disuelto en solución salina. A los 10 min después de la inyección, se sacrificó a los ratones y se extrajo la aorta, seguido de fijación con una solución de formalina al 10%. La aorta se observó bajo un microscopio óptico para tomar fotografías. Se midió el área teñida con colorante Evans Blue para evaluar el daño de la capa endotelial.

Las muestras de aorta humana lisadas se mezclaron con tampón de muestra no reductor 5x (312,5 mmol/l de Tris-HCl [pH 6,8], 11,5 % de SDS, 40 % de glicerol) y se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 7,5 % que contenía 4 mg/ml. gelatina. Después de SDS-PAGE, el gel se lavó dos veces con tampón de lavado (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7,5], 2,5 % Triton X-100, 5 mmol/L CaCl2, 1 µmol/L ZnCl2) a 37 °C durante 30 min cada vez, y luego se incuba en tampón de incubación (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7,5], 1 % Triton X-100, 5 mmol/L CaCl2, 1 µmol/L ZnCl2) durante 10 min con agitación suave, seguido de reemplazo con tampón de incubación fresco e incubación durante 24 h a 37 ° C. Después de la tinción con azul brillante de Coomassie (CBB; Nacalai Tesque), las áreas de degradación de gelatina eran visibles como bandas claras y nítidas contra un fondo azul del sustrato no degradado. Las densidades de banda se analizaron utilizando el software ImageJ (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.).

Los lisados ​​de las VSMC aórticas se aclararon previamente con perlas de proteína G Sepharose (GE Healthcare) para eliminar las proteínas que no se unen específicamente a las perlas. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se incubaron con el anticuerpo primario indicado (dilución 1:100) durante la noche a 4 °C, seguido de una incubación con perlas de proteína G Sepharose durante 2 ha 4 °C. Las muestras se centrifugaron a 3000 × g durante 1 min a 4 °C y las perlas se lavaron tres veces con tampón RIPA. Las proteínas unidas a las perlas se eluyeron en tampón de carga de muestra 2x y se usaron en transferencia Western.

Para el análisis LC-MS/MS, el gel se tiñó con CBB durante la noche y las bandas de proteínas específicas en el carril GFP-RhoA-WT se eliminaron después de la decoloración. Los cortes de gel se empaparon en acetonitrilo al 50 % y solución de bicarbonato amónico 50 mmol/l para decolorar por completo la CBB. Después de lavar con agua desionizada, los cortes se empaparon en acetonitrilo al 100 % durante 15 min y se secaron por completo con Savant SpeedVac (Thermo Fisher Scientific). Las proteínas en los cortes de gel se digirieron con 800 ng/40 μL de mezcla de tripsina: lisil endopeptidasa (1:1) a 37 °C durante 16 h. Las muestras de péptidos digeridos se transfirieron a un tubo nuevo y se desalinizaron con C18-StageTip (Thermo Fisher Scientific). Después de que las muestras se secaron con Savant SpeedVac, se agregaron 10 μL de solución de ácido fórmico al 0,1 %/acetonitrilo al 3 % para solubilizar los péptidos para la siguiente aplicación.

Para LC, se aplicaron 2 μL de la muestra al Nanoflow UPLC (UltiMate 3000 RSLCnano LC System, Thermo Fisher Scientific) equipado con una Nanocolumn (columna de 75 μm × 125 mm rellena con una resina ReproSil-Pur C18-AQ de fase inversa; Nikkyo Technos Co., Ltd, Tokio, Japón) a 40 °C. El programa de elución en gradiente con la fase móvil A (0,1 % de ácido fórmico en agua) y la fase móvil B (0,1 % de ácido fórmico en 80 % de acetonitrilo) se realizó para la separación de los péptidos absorbidos: fase B, 2 %–8 % durante 0–4 min, 8%–30% durante 4–26 min, 30%–65% durante 26–34 min. Posteriormente, se llevó a cabo espectrometría de masas en tándem (MS/MS) usando espectrometría de masas Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific). La fuente de ionización por electropulverización se hizo funcionar con el modo de iones positivos, el voltaje se fijó en 1,7 kV y el capilar de transferencia de iones se fijó en 275 °C. Los espectros de MS1 se recolectaron en el rango de 380 a 1240 m/z a una resolución de 60 000 para alcanzar un objetivo AGC de 3 × 106. Los 40 iones precursores principales con estados de carga de 2+ a 5+ se seleccionaron para fragmentación con energía de colisión normalizada escalonada del 22%, 26% y 30%. Los espectros de MS2 se recopilaron a una resolución de 15 000 para alcanzar un objetivo de AGC de 1 × 105. El tiempo de exclusión dinámica se estableció en 12 s. El procesamiento de datos sin procesar y el análisis mediante búsquedas en la base de datos se realizaron con PEAKS STUDIO Desktop Version X +, con referencia a 17 023 entradas de proteínas en la base de datos de ratones UniProtKB/Swiss-Prot (UniProt id UP000000589, revisado, canónico; descargado el 10 de febrero de 2020) . Los parámetros del software se establecieron de la siguiente manera: la oxidación (+15,99 Da) (residuos de metionina) se estableció como modificaciones variables consideradas de las proteínas; se permitieron las escisiones de tripsina; la tolerancia de masa de iones precursores se fijó en ±10,0 ppm y la tolerancia MS/MS se fijó en 0,015 Da; el umbral de identificación de proteínas se estableció en <1 % para las tasas de falso descubrimiento de péptidos y proteínas. Para estimar la tasa de descubrimiento falso en el software de estudio PEAKS, se aplicó el método de fusión señuelo. El análisis del proteoma fue realizado por el Instituto de Investigación de ADN Kazusa (Kisarazu, Japón). Se utilizó el software PSOPIA (Instituto Nacional de Innovación Biomédica, Salud y Nutrición, Ibaraki, Japón) para el análisis in silico para identificar las proteínas que pueden interactuar con los componentes del complejo STRIPAK, que modula la actividad de MAP4K4.

El RhoA unido a GTP activo se detectó mediante un ensayo desplegable como se describió anteriormente con algunas modificaciones52. Brevemente, las células se lisaron en el tampón de lisis celular (50 mmol/l de Tris/HCl [pH 7,5], 0,5 mol/l de NaCl, 10 mmol/l de MgCl2, 1 % de Triton X-100). El extracto celular se obtuvo por centrifugación y luego se incubó con glutatión S-transferasa fusionada con el dominio de unión a mDia Rho conjugado con perlas de glutatión sefarosa (GE Healthcare) a 4 °C durante la noche para recolectar RhoA unido a GTP. Después de lavar las perlas con el tampón de lisis celular, las proteínas unidas a las perlas se eluyeron con tampón de muestra SDS y se sometieron a SDS-PAGE, seguido de transferencia Western con anticuerpo anti-RhoA. La proteína activa que interactúa con GTP Set también fue detectada por un anticuerpo anti-Set.

El conjunto de ARNsi y el ARN de control negativo (Scramble) se produjeron utilizando el kit de transcripción in vitro CUGA7 (Nippon Gene, Tokio, Japón). Las secuencias de siRNA son las siguientes: Set siRNA 5′-GGATGAAGGTGAAGAAGAT-3′ y Scramble 5′-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3′. La transfección de siRNA se realizó utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

Todos los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces de forma independiente. El análisis estadístico se realizó con el software Prism 9 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Las diferencias estadísticas entre los grupos experimentales se evaluaron mediante la prueba exacta de Fisher, la prueba t de Student de dos colas, el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) o ANOVA de medidas repetidas de dos vías. Si ANOVA indicaba significación general, las diferencias individuales se evaluaban mediante la prueba posterior de Bonferroni. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las imágenes de transferencia Western sin recortar se muestran en las figuras complementarias. 11–14, y todos los datos de origen subyacentes a los gráficos de las figuras principales se muestran en Datos complementarios 2. Los plásmidos recién generados en este estudio se depositan en Addgene (https://www.addgene.org/) con el número de ID de depósito 81677 Los datos de proteómica basados ​​en espectrometría de masas se depositan en ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD03682558. Todos los demás conjuntos de datos generados y/o analizados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos al Sr. Takefumi Yamamoto del Laboratorio Central de Investigación y al Prof. Eiichiro Nishi del Departamento de Farmacología de la Universidad de Ciencias Médicas de Shiga por su excelente asistencia técnica en este estudio. Este estudio fue financiado en parte por subvenciones para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia para A.Shimizu [21K06854], MK [21K16086], A.Sato [21K09419] y HO [17K08627 y 20K08489]; Takeda Science Foundation, The Naito Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation y Uehara Memorial Foundation for HO

División de Bioquímica Médica Molecular, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Ciencias Médicas de Shiga, Otsu, Japón

Md Rachel Molla, Akio Shimizu, Masahiro Komeno, Nor Idayu A. Rahman, Joanne Ern Chi Soh, Le Kim Chi Nguyen, Mahbubur Rahman Khan, Wondwossen Wale Tesega, Si Chen, Xiaoling Pang, Akira Sato & Hisakazu Ogita

Departamento de Emergencias, Cuarto Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China, Shenyang, China

Si Chen y Xiaoling Pang

Departamento de Biología Molecular, Instituto Internacional del Cáncer de Osaka, Osaka, Japón

Miki Tanaka-Okamoto

División de Cirugía Cardiovascular y Cirugía Torácica, Departamento de Cirugía, Universidad de Ciencias Médicas de Shiga, Otsu, Japón

Noriyuki Takashima y Tomoaki Suzuki

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Diseñar estudios de investigación (MRM, A.Shimizu y HO), realizar experimentos y adquirir datos (MRM, A.Shimizu, MK, NIAR, JECS, LKCN, MRK, WWT, SC, XP, MT-O. y A. Sato), analizar datos (MRM, A.Shimizu, NT, TS y HO), proporcionar muestras (MT-O., NT y TS) y escribir el manuscrito (MRM, A.Shimizu y HO).

Correspondencia a Hisakazu Ogita.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Toshiro Moroishi y Manuel Breuer. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Molla, MR, Shimizu, A., Komeno, M. et al. El músculo liso vascular RhoA contrarresta la formación de aneurismas aórticos abdominales al modular la actividad de MAP4K4. Commun Biol 5, 1071 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04042-z

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Recibido: 08 Abril 2022

Aceptado: 27 de septiembre de 2022

Publicado: 07 octubre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04042-z

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