La glía cortical en ratones SOD1 (G93A) se ve sutilmente afectada por ALS

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6538 (2023) Citar este artículo

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El papel de la glía en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es innegable. Su actividad relacionada con la enfermedad se ha estudiado ampliamente en la médula espinal, pero solo parcialmente en el cerebro. Presentamos aquí un estudio exhaustivo de la glía en la corteza de ratones SOD1 (G93A), un modelo ampliamente utilizado de ALS. Usando secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) e inmunohistoquímica, inspeccionamos astrocitos, microglia y oligodendrocitos, en cuatro etapas de la enfermedad, respetando el factor del sexo. Reportamos cambios mínimos de glía a lo largo de la progresión de la enfermedad e independientemente del sexo. Los análisis de seudobulto y de una sola célula revelaron sutiles alteraciones transcripcionales relacionadas con la enfermedad en la etapa final en microglía y oligodendrocitos, que fueron respaldadas por inmunohistoquímica. Por lo tanto, nuestros datos respaldan la hipótesis de que la corteza del ratón SOD1 (G93A) no recapitula la enfermedad en los pacientes y recomendamos el uso de un modelo diferente para futuros estudios de la patología cortical de la ELA.

La degeneración característica de las neuronas motoras (MN) en la ELA provoca inicialmente una atrofia muscular progresiva que conduce a dificultades con el movimiento, el habla y la deglución, e insuficiencia respiratoria en la etapa final. En general, la ELA se considera una enfermedad multifactorial con mecanismos patológicos poco conocidos y con una mediana de supervivencia de tres a cinco años. Actualmente no existe una cura o prevención disponible, solo un tratamiento sintomático.

Aunque los MN se reconocen como el tipo de célula principal afectado por la patología, múltiples estudios han confirmado que también las células no neuronales, incluida la glía, sufren cambios y participan en la progresión de la ELA1,2. Las células gliales responden a la neurodegeneración o lesión por varios mecanismos. La microglía y los astrocitos adquieren el llamado estado reactivo marcado por cambios en la expresión génica y la morfología. Mediante la activación de vías inflamatorias y antiinflamatorias, protegen el tejido de daños mayores. Sin embargo, en la etapa crónica de las enfermedades tienen un efecto nocivo y contribuyen a la progresión de la neurodegeneración. Tradicionalmente, los astrocitos reactivos y la microglía se dividían en los subtipos A1 y A2 o M1 y M2, respectivamente. Sin embargo, esta terminología actualmente se considera obsoleta, ya que recientemente se han descrito muchas subpoblaciones de glía con firmas genéticas específicas en diferentes modelos de enfermedades3,4,5. Los astrocitos asociados a la enfermedad (DAA), la microglia asociada a la enfermedad (DAM), la microglia de respuesta activada (ARM) y la microglia de respuesta al interferón (IRM) son solo algunos ejemplos de estos. Los oligodendrocitos, por otro lado, son más susceptibles a cambios patológicos. En reacción a la enfermedad, tienden a degenerar, en lugar de transformarse en un estado reactivo. Sin embargo, su papel pasivo en la progresión de la enfermedad ha sido cuestionado recientemente por estudios que describen su contribución a la inmunoprotección, la señalización del interferón y el procesamiento y presentación de antígenos6,7.

El papel de los astrocitos, la microglía y los oligodendrocitos, y sus respectivos cambios relacionados con la patología, se han informado en pacientes con ELA en múltiples ocasiones8,9,10. La mayoría de los datos disponibles provienen de la médula espinal, pero algunos estudios también informaron patología glial en la corteza11. Los cambios patológicos conocidos se identificaron principalmente en tejido post mortem, lo que no permite el estudio de los mecanismos de la enfermedad, lo que aumenta la necesidad de un modelo animal fiable. Actualmente, el ratón SOD1 (G93A) representa el modelo más utilizado que se asemeja a ALS12 familiar. Fenotípicamente, el modelo coincide con el curso de la enfermedad, y los estudios en la médula espinal y el tronco encefálico informaron cambios celulares relacionados con la ELA previamente encontrados en pacientes2,8,13,14,15,16. La corteza, sin embargo, parece ser un tema de controversia. El número de estudios es limitado y los resultados sugieren resultados contradictorios. Mientras que algunos muestran que las células gliales corticales y los MN se ven afectados por el fenotipo similar a ALS17,18,19,20, otros no informan ningún efecto en el área cortical en el modelo SOD1 (G93A)21.

En este estudio, nuestro objetivo fue proporcionar una visión integral de la patología glial SOD1 en la corteza del ratón SOD1 (G93A). Combinando métodos robustos y de alto rendimiento como scRNA-seq e inmunohistoquímica, analizamos astrocitos, microglia y oligodendrocitos durante el curso completo de la enfermedad, que se caracterizó mediante pruebas de comportamiento. El scRNA-seq se utilizó para monitorear los cambios transcripcionales en células gliales individuales en el tiempo y para investigar la composición de distintas poblaciones gliales con un enfoque particular en las subpoblaciones asociadas a enfermedades. Para completar la caracterización de la patología cortical, evaluamos los cambios morfológicos y cuantitativos de las células gliales mediante inmunohistoquímica, midiendo marcadores proteicos canónicos.

Para todos los experimentos, utilizamos ratones transgénicos que expresaban altos niveles de SOD1 humana (G93A) (Cepa JAX: 004435 C57BL/6 J-Tg (SOD1*G93A)1Gur/J) y sus compañeros de camada no portadores12. Esta cepa contiene ~ 25 copias del transgén y su 50 % de supervivencia oscila entre 157 ± 9,3 días (https://www.jax.org/strain/004435). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la República Checa (número de aprobación 40/2019). Todos los métodos que utilizan animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas (86/609/EEC). Todos los animales utilizados para los experimentos fueron sacrificados utilizando pentobarbital seguido de decapitación. Debido a una etapa avanzada de la enfermedad, los ratones mutantes fueron sacrificados con dióxido de carbono poco después de cumplir los cinco meses de edad. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar tanto el sufrimiento como el número de animales utilizados. El estudio se informa de acuerdo con las directrices ARRIVE.

Llevamos a cabo la prueba de suspensión de rejilla de alambre y la prueba de varilla giratoria (Mouse RotaRod NG 47650, Ugo Basile, Italia) para evaluar la fuerza muscular, la función y la coordinación a lo largo de la enfermedad. El peso también se midió como un parámetro adicional de la progresión de los síntomas. La prueba consistió en una sola sesión de tres intentos cada semana, comenzando en P30 y duró 14 semanas. Antes del experimento, todos los animales realizaron entrenamiento. Los datos se presentan como media o media ± error estándar de la media (SEM) para n animales. Se utilizó ANOVA bidireccional de medidas repetidas con la corrección de comparación múltiple de Holm-Sidak para analizar las diferencias entre los grupos.

El ratón se colocó sobre una tapa de alambre hecha a medida, aproximadamente 60 cm por encima de un fondo cubierto con astillas de madera, y se le dio la vuelta. Se midió la latencia a la caída. Al comienzo de un período de prueba, entrenamos a cada ratón tres veces consecutivas durante al menos 180 s. En la sesión experimental, el ratón tuvo tres intentos de agarrarse a la tapa. Anotamos la mejor puntuación de las tres con un máximo de 180 s.

El ratón se colocó en una barra estacionaria frente a la dirección de rotación. La varilla comenzó a girar a una velocidad constante de 15 rpm y se midió la latencia a la caída. Cada ratón fue entrenado tres veces consecutivas de al menos 180 s a una velocidad de 5, 10 y 15 rpm. En la sesión experimental, el ratón tuvo tres intentos de permanecer en la barra. Anotamos la mejor puntuación de las tres con un máximo de 180 s.

Para los análisis inmunohistoquímicos, los animales se anestesiaron profundamente con PTB (100 mg/kg, ip), se perfundieron transcardiacamente con 20 ml de solución salina seguidos de 20 ml de paraformaldehído (PFA) al 4 % enfriado en tampón de fosfato 0,1 M y se decapitaron. Los cerebros y las médulas espinales se diseccionaron, se fijaron posteriormente durante la noche con PFA y se trataron con un gradiente de sacarosa (que osciló entre el 10 y el 30%) para la crioprotección. Se prepararon cortes coronales de 30 μm de espesor utilizando un criostato (Leica CM1850, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).

Para la tinción inmunohistoquímica, los cortes se lavaron en solución salina tamponada con fosfato seguido de bloqueo de los sitios de unión no específicos con Chemiblocker al 5% (Millipore, Billerica, MA) y Triton al 0,2% en solución salina tamponada con fosfato. La solución de bloqueo también se usó como diluyente para los antisueros. Los cortes se incubaron con los anticuerpos primarios durante la noche y los anticuerpos secundarios se aplicaron durante 2 h a 4–8 °C.

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: familia antialdehído deshidrogenasa 1 de conejo, miembro L1 (ALDH1L1 1:500; Abcam, Cambridge, Reino Unido), proteína básica antimielina de rata (MBP, 1:500, Biorad, Hercules, CA, EE. UU. ), anti-colina acetiltransferasa de conejo (ChAT, 1:200, Merck, Darmstadt, Alemania), molécula adaptadora de unión al calcio anti-ionizado de conejo 1 (Iba-1, 1:500, Abcam, Cambridge, Reino Unido), caspasa escindida de conejo -3 (CC3, 1:50, CellSignaling, Massachusetts, EE. UU.) y poliposis coli adenomatosa (APC, 1:200, Merck, Darmstadt, Alemania). Los anticuerpos secundarios fueron IgG anti-conejo de cabra o IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 488, e IgG anti-rata de pollo conjugado con Alexa Fluor 488 (1:500, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). Los núcleos celulares se visualizaron mediante tinción DAPI (Merck, Darmstadt, Alemania). Para el análisis inmunohistoquímico se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM 880 Airyscan equipado con láser Ar/HeNe y objetivos de agua × 40 o de aceite × 63.

Todos los análisis se realizaron con el software de procesamiento de imágenes FIJI (ImageJ 2.9.0/1.53t)22. Se tomaron imágenes confocales (212 × 212 × 30 μm) de cortes coronales del cerebro (1 mm y 2 mm de bregma), que cubren el área del motor primario y secundario y la corteza somatosensorial primaria (cinco a seis zonas por hemisferio).

Para cuantificar la intensidad de fluorescencia de ALDH1L1, usamos seis animales para cada grupo y dos cortes de cada animal. El método de umbralización (método Yen) se utilizó para filtrar el fondo. Calculamos la densidad integrada media limitada al umbral para cada animal.

Para cuantificar los cambios en la morfología de la microglía, realizamos un análisis de Sholl en células positivas para IBA1 utilizando el complemento de análisis de Sholl23. Utilizamos seis animales por grupo y dos cortes de cerebro de cada animal. Para cada corte de cerebro, se analizó un mínimo de ocho células. Para el análisis de Sholl, las imágenes consecutivas de la pila z se convirtieron a proyección de máxima intensidad y la proyección se fijó en el umbral para crear una máscara binaria. Contamos el número de intersecciones a partir de 5 μm desde el centro del soma, con un tamaño de paso de radio de 5 μm.

Para cuantificar las células positivas para APC y CC3, se utilizaron para el análisis tres animales de cada grupo y un corte (1 mm de bregma) de cada animal. El número de células positivas para APC o CC3 se determinó a partir de imágenes superpuestas y se expresó como el porcentaje de células que expresan marcador del número total de células DAPI+. A continuación, se expresó el porcentaje de células apoptóticas como una relación de CC3+ con respecto a las células APC+ previamente contadas.

Se utilizó un microscopio confocal Olympus FV10i equipado con un objetivo de aceite × 60 para el análisis de la tinción de MBP. Usamos seis animales para cada grupo y dos cortes para cada animal y escaneamos 12 zonas por cada hemisferio. La densidad de expresión de MBP se determinó utilizando la macro FIJI (ImageJ) escrita a medida (disponible en: https://github.com/jakubzahumensky/JT_paper). En resumen, para mantener igual la dimensionalidad de las imágenes analizadas, la macro extrajo una subpila de los 20 fotogramas más brillantes de cada pila z. Esto fue seguido por la creación de una máscara binaria de las fibras en cada cuadro y la medición de la fracción del cuadro cubierta por la máscara. Dentro de cada subpila, se calculó la media de este valor, dando como resultado la fracción de volumen ocupada por las fibras. El análisis estadístico de las diferencias entre grupos se realizó mediante la prueba t no pareada. Todas las barras de error en los gráficos representan el error estándar de la media (SEM).

Los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital (PTB) (100 mg/kg, ip) y se perfundieron transcardiacamente con un tampón de aislamiento frío (4–8 °C) que contenía (en mM): NaCl 136,0, KCl 5,4, HEPES 10,0, glucosa 5,5, osmolalidad 290 ± 3 mOsmol/kg. Aislamos la corteza somatosensorial primaria y motora y seguimos el protocolo de disociación de cerebro adulto para ratones y ratas (Milteyni-Biotec, Alemania), pero omitimos el paso de eliminación de glóbulos rojos. Para prevenir la activación de genes tempranos inmediatos (IEG), utilizamos el inhibidor transcripcional actinomicina D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 30 μM durante la disociación enzimática y 3 μM en los siguientes pasos24. Después de la eliminación de los desechos, las células se colocaron en capas sobre 5 ml de solución inhibidora de ovomucoide (Worthington, NJ) y se recolectaron por centrifugación (300 × g durante 6 min). Los agregados celulares potenciales se eliminaron mediante filtros celulares de 70 μm (Becton Dickinson, NJ). Marcamos la suspensión final con anticuerpos ACSA-2, Cd11b y O4 conjugados con aloficocianina y ficoeritrina respectivamente (4 °C, 10 min; Miltenyi-Biotec, Alemania) para permitir el enriquecimiento de astrocitos25, microglía y oligodendrocitos. Las células se enriquecieron mediante citometría de flujo (FACS; BD Influx), se calibraron para clasificar las células ACSA-2+, Cd11b+ y O4+. Se utilizó Hoechst 33258 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) para comprobar la viabilidad. Las células se recogieron en 200 μl de medio Eagle modificado de Dulbecco avanzado, complementado con suero bovino fetal al 10% (ThermoFisher Scientific Waltham, MA). Se agruparon cuatro animales por condición para la preparación de la suspensión celular. Después de FACS, la suspensión de células se centrifugó, se concentró y se usó para la preparación de bibliotecas.

Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 (10 × Genomics, Pleasanton, CA) se utilizó para preparar las bibliotecas de secuenciación y el protocolo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se utilizó la plataforma 10 × Chromium para encapsular células individuales en gotitas junto con perlas cubiertas con códigos de barras 10 × específicos de células, identificadores moleculares únicos (UMI) y secuencias poli(dT). Después de la transcripción inversa, las bibliotecas de ADNc se amplificaron (13–14 ciclos), se fragmentaron y se ligaron a adaptadores de secuenciación. Se usaron perlas magnéticas SPRISelect para la purificación de la suspensión de ADNc y la selección del tamaño de los fragmentos. La concentración y la calidad de las bibliotecas se midieron con el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen) y el kit Fragment Analyzer HS NGS Fragment (#DNF-474, Agilent). Las bibliotecas se agruparon y secuenciaron en modo emparejado utilizando el kit de reactivos Illumina NovaSeq 6000 SP, Lectura 1 que contenía un código de barras y un UMI, y Lectura 2 que cubría la secuencia de interés. Datos de secuenciación compuestos por aprox. 100–200 millones de lecturas por muestra (Sup. Tab. 4).

Los datos de secuenciación se alinearon con el genoma de ratón de referencia GRCm38 y se anotaron (anotación GENCODE versión M8) mediante STARsolo (STAR ​​versión 2.7.3a)26. Se aplicó la función EmptyDrops (paquete DropletUtils R) 27 con un umbral de 100 UMI y FDR < = 0.001 para preservar solo las gotas que contienen células. Las células se contaron en función de los códigos de barras específicos para cada gota/célula. El número final de células detectadas difirió entre las muestras y estuvo en el rango de aprox. de 2500 a 6800 celdas (Tabla Suplementaria 4).

Los datos se procesaron posteriormente utilizando el paquete Seurat R (versión 4.1.1)28. En primer lugar, los datos de todas las muestras se transformaron en SC y se integraron (excluyendo los genes mitocondriales y ribosómicos, con el prefijo mt- o Rps/Rpl, respectivamente). Se utilizó Uniform Manifold Aproxi- mation and Projection (UMAP) para visualizar 17 componentes principales (PC), que posteriormente se agruparon (funciones FindNeighbors y FindClusters, resolución UMAP 0.5). Los grupos se anotaron en función de la expresión de genes marcadores conocidos de las poblaciones de células esperadas y su correspondencia con los marcadores encontrados por la función FindAllMarkers (al menos el 80 % de las células en el grupo expresan los marcadores). El paquete DoubletFinder29 R se utilizó para la identificación de gotitas que potencialmente contenían más de una célula. La tasa de formación de dobletes se fijó en 3,9 % según lo estimado por 10 × Genomics, y los datos se procesaron de acuerdo con las recomendaciones de los autores. Los grupos que expresaban marcadores ambiguos y que contenían un mayor número de dobletes se filtraron del conjunto de datos.

El sexo (masculino, femenino) se asignó a las células individuales en función de la expresión de los genes codificados por los cromosomas X (Xist) e Y, y aquellos que no coincidían con nuestros criterios (masculino: recuentos de Xist < 1, nFeature_Y > 0; femenino: recuentos de Xist> 0, nFeature_Y < 2, nCount_Y < 2; nFeature_Y es una cantidad de genes codificados en Y y nCount_Y es una cantidad de transcripciones que se asignan al cromosoma Y) se excluyeron del conjunto de datos (Supp. Fig. 1a). Estas celdas clasificadas como 'Indefinidas' comprendían casi 1/3 del número total de celdas y representaban celdas de baja calidad (Supp. Fig. 1b).

También se utilizó un perfil de expresión génica específico para determinar una fase del ciclo celular de cada célula (función CellCycleScoring Seurat) para garantizar que las células en todas las fases se distribuyen por igual entre los grupos. Los tipos de células individuales se filtraron según la cantidad de genes detectados (nFeature_RNA), la cantidad de recuentos (nCount_RNA) y la cantidad de RNA mitocondrial (percent.mt). Los puntos de corte específicos para cada tipo de célula de interés fueron los siguientes: astrocitos: nFeature_RNA > 1000, 2000 < nCount_RNA < 10 000, percent.mt < 8; microglía: nFeature_RNA > 700, 1000 < nCount_RNA < 10 000, percent.mt < 5; oligodendrocitos: nFeature_RNA > 1300, 2500 < nCount_RNA < 50 000, percent.mt < 5 (Supp. Fig. 1d). La disociación de tejidos puede inducir la expresión de IEG, la primera respuesta celular rápida a los estímulos24,30. Se proyectó un conjunto de IEG (p. ej., factores de transcripción Fos y Jun) en el UMAP utilizando la función AddModuleScore para investigar el nivel de inducción de estos genes mediante la preparación de la muestra (Supp. Fig. 1c). Se aplicó el paquete SoupX R (versión 1.5.2)31 para eliminar el fondo de ARN contaminante. Los datos sin filtrar y anotados se proporcionaron como entrada. La fracción de contaminación se estimó por el método automatizado y estuvo en el rango de 1 a 2 % para muestras individuales. Los valores de recuento se corrigieron posteriormente por la contaminación.

Para ver las diferencias generales entre las muestras mediante el análisis de componentes principales (PCA) de pseudobulto, se utilizó el conjunto de datos normalizados y escalados para crear datos de pseudobulto sumando los recuentos de genes de células pertenecientes a la misma condición, edad y sexo.

Los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en el conjunto de datos de una sola célula se identificaron mediante la prueba t en la función FindMarkers de Seurat. En este análisis se utilizaron datos normalizados y escalados en el ensayo de ARN. El umbral del valor ajustado de P (padj) se estableció en 0.05, y los genes con cambio de veces log2 (log2FC)> 1 o <-1 se consideraron expresados ​​diferencialmente. Se compararon machos y hembras en cada punto de tiempo para cada tipo de célula y condición. Los pares de control (CTRL) y SOD1 también se probaron en cada momento y para cada tipo de célula (DEG de etapa final en la Tabla complementaria 1). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)32 se realizó con el paquete clusterProfiler R (versión 4.0.5)33,34. El tamaño del conjunto de genes de referencia se limitó a 10–800 genes y el umbral de importancia se estableció en padj = 0,05. Solo se consideraron relevantes los resultados en los que más de un gen contribuyó al enriquecimiento (enriquecimiento del núcleo).

Los tipos de células individuales de interés (astrocitos, microglía, oligodendrocitos) se analizaron por separado. Los genes mitocondriales y ribosómicos no se incluyeron en los análisis posteriores. Los datos filtrados, normalizados, escalados y SCTransformed se sometieron luego a PCA. En el ámbito del control de calidad, se excluyeron varios genes, ya que introdujeron una variabilidad indeseable adicional en el agrupamiento (Sod1, Gm8566, Cmss1, Cdk8 y lncRNAs Xist, Gm42418, Gm424181, Malat1). Se visualizaron 16 PC para microglía y astrocitos y 17 PC para oligodendrocitos usando UMAP y se agruparon a una resolución de 0,2 (funciones FindNeighbors y FindClusters). Un grupo de células de control masculinas en el punto de tiempo de 3 M se excluyó de los subconjuntos de astrocitos y oligodendrocitos, ya que expresaba genes marcadores potencialmente relacionados con el estrés (p. ej., Cdkn1a, Fkbp5), que podrían haberse inducido durante la preparación de la muestra (Supp. Fig. 2).

Los marcadores de los subgrupos se identificaron mediante la prueba de Wilcoxon predeterminada en la función FindAllMarkers (al menos el 10 % de las células en un grupo que expresa el marcador dado, log2FC > 0,25, Supp. Tab. 3). La identidad de los subgrupos se determinó mediante la comparación con las firmas genéticas disponibles de varios subtipos celulares descritos previamente utilizando la función AddModuleScore y mediante la anotación manual basada en los genes marcadores calculados. Las firmas de expresión génica de referencia se tomaron de Habib et al.5 (astrocitos Gfap-Low y Gfap-High), Sala Frigerio et al.4 (ARM, IRM) y Marques et al.35 (MFOL1/2, MOL2, MOL5/6 ). El estado intermedio de los astrocitos se visualizó utilizando un conjunto de genes que contenía marcadores calculados del grupo 2 y marcadores de estado de transición publicados por Habib et al.5. La firma de microglía homeostática resultó de la combinación de marcadores homeostáticos mencionados en Keren-Shaul et al.3, Mathys et al.36 y Butovsky y Weiner37. Los 30 genes principales se usaron para la proyección en astrocitos, y 20 genes se usaron en la microglía y los oligodendrocitos. Los números de células que ingresan al análisis de expresión diferencial (DEA) y al análisis de subpoblaciones se proporcionan en Supp. Pestaña. 4.

En primer lugar, investigamos los cambios fenotípicos esperados relacionados con la enfermedad característicos del modelo animal utilizado en este estudio. Nuestro objetivo fue evaluar los principales puntos de inflexión de la enfermedad y caracterizar su progresión.

Para estudiar el fenotipo, utilizamos dos tipos de pruebas de comportamiento: la prueba de suspensión de rejilla de alambre y la prueba de rendimiento de rotarod. Probamos grupos comparables de animales que albergaban la mutación SOD1 (G93A) (SOD1) y animales de control (CTRL) con números pares de machos y hembras dentro de cada grupo. Al comienzo del período de prueba (1 mes), todos los animales realizaron el tiempo máximo (180 s) en ambas pruebas (ver la sección "Métodos"). Las diferencias entre los animales CTRL y SOD1 se notaron por primera vez en la prueba de suspensión de la rejilla de alambre, donde se evalúa principalmente la fuerza muscular (Fig. 1a). Las diferencias se hicieron significativas a los dos meses de edad, por lo que consideramos este punto como un inicio. Luego, el rendimiento declinó lentamente hasta una caída repentina a los tres meses, lo que indica el comienzo de la etapa sintomática. Esta etapa, acompañada de una disminución aún mayor del rendimiento, duró aproximadamente un mes, después del cual los animales llegaron a la etapa final marcada por funciones motoras gravemente dañadas. La disminución en la coordinación motora de los animales medida por el rotarod (Fig. 1c) solo fue significativa en la etapa final.

La evaluación de la patología cortical mediante pruebas de comportamiento e inmunohistoquímica. ( a ) La prueba de alambre colgante confirmó la disminución de las habilidades motoras en los animales SOD1 durante la progresión en comparación con los CTRL. ( b ) Los resultados de la prueba de alambre colgante que compara animales SOD1 divididos según el sexo revelaron diferencias fenotípicas en el inicio. (c), (d) Los resultados del rotarod que comparan los animales CTRL y SOD1 no revelaron cambios significativos en la progresión. La significancia estadística se determinó usando ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Holm-Sidak, las barras de error representan SEM. *padj ≤ 0,05, **padj ≤ 0,01, ***padj ≤ 0,001. n indica el número de animales que actúan.

Al investigar el rendimiento masculino versus femenino de SOD1, la prueba de suspensión de la rejilla de alambre reveló diferencias en el inicio de los síntomas y la progresión en general (Fig. 1b). En los machos, el inicio fue más temprano y, en general, se comportaron peor que las hembras, lo que está de acuerdo con la patología humana38. Sin embargo, a pesar del inicio tardío, el desempeño femenino en la etapa sintomática declinó más rápido que el masculino, resultando en resultados similares para ambos sexos en la etapa final. Las mediciones del rotarod no revelaron ninguna diferencia significativa relacionada con el sexo en la coordinación motora durante la progresión.

Por lo tanto, las pruebas de comportamiento confirmaron los rasgos característicos del modelo, identificaron diferencias relacionadas con el sexo y determinaron los cuatro momentos principales de la enfermedad, que consideramos en los siguientes experimentos.

El experimento scRNA-seq se diseñó de la siguiente manera (Fig. 2a): los ratones CTRL y SOD1 se sacrificaron en cuatro puntos de tiempo, que representan las etapas principales de la enfermedad, con dos machos y dos hembras utilizados por condición en cada punto de tiempo. Todas las suspensiones celulares se prepararon a partir del tejido cortical motor y somatosensorial y se enriquecieron para tres tipos de células gliales (astrocitos, microglía y oligodendrocitos) utilizando FACS.

Descripción general del experimento de secuenciación de ARN de una sola célula. (a) Un esquema que resume el proceso del experimento de secuenciación. (Creado con BioRender.com) (b) Una visualización de gráficos UMAP de los grupos de células identificados, que contienen células de todas las muestras. ASTRO n = 5536, MG n = 8429, OLIGO n = 6180, PVM n = 434, OPC n = 165, COP n = 98, PERI n = 395, ENDO n = 235, ENDO/PERI n = 108, total n = 21,580. ( c ) Una visualización de la representación del grupo y la prevalencia de la glía específica en ambas condiciones y sexos. CTRL n = 7646, SOD1 n = 12,499, femenino n = 10,246, masculino n = 9899. ( d ) Una lista de genes marcadores canónicos utilizados para la identificación de grupos de células. ASTRO: astrocitos, MG: microglía, PVM: macrófagos perivasculares, OPC: células precursoras de oligodendrocitos, COP: precursores de oligodendrocitos comprometidos, OLIGO: oligodendrocitos, PERI: pericitos, ENDO: células endoteliales.

Los datos de scRNA-seq siguieron un control de calidad inicial, filtrado y agrupación, y el conjunto resultante de células individuales se anotó utilizando la expresión de genes marcadores canónicos de poblaciones de células gliales individuales (Fig. 2b, d). Como era de esperar, los grupos más numerosos en el conjunto de datos se identificaron como astrocitos (Aqp4, Aldh1l1, Gjb6), microglia (Cx3cr1, Aif1) y oligodendrocitos (Mobp, Apod). Las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) y las células precursoras de oligodendrocitos comprometidas (COP) se agruparon por separado de los oligodendrocitos maduros que prevalecieron en el conjunto de datos. Los genes marcadores de estas poblaciones se superpusieron parcialmente, lo que indica una maduración gradual de las OPC en oligodendrocitos (Emid1, Pdgfra, Sox6, Vcan, Plp1, Cldn11 y otros). Además, los macrófagos perivasculares, los pericitos y las células endoteliales estaban presentes en una minoría.

A cada célula se le asignó una identidad sexual basada en la expresión de genes asociados a los cromosomas X e Y. Las células que no cumplían con los criterios para la determinación del sexo (ver Métodos, Suplemento Fig. 1a, b) se excluyeron de análisis posteriores. Ningún grupo de células estuvo sobrerrepresentado específicamente en CTRL o SOD1, o en las muestras masculinas o femeninas, lo que confirma la solidez de la preparación celular (Fig. 2c). Además, la baja proporción de lecturas mitocondriales y la activación mínima de genes tempranos inmediatos validaron aún más la calidad de los datos (Supp. Fig. 1c, d). En general, identificamos con éxito las poblaciones de células objetivo en el conjunto de datos y observamos sus proporciones iguales en ambas condiciones y sexos.

Para proporcionar una visión general de los cambios en la expresión génica en ratones SOD1, cada uno de los principales tipos de células se sometió a PCA como un pseudobulto (Fig. 3a). El análisis reveló una alteración menor entre las muestras CTRL y SOD1 en ambos sexos durante la progresión de la enfermedad. El primer cambio aparente entre las muestras apareció a los cuatro meses de edad en microglía y oligodendrocitos, lo que sugiere su reacción a una patología similar a la ELA. Los astrocitos SOD1, que con frecuencia se informa que se activan en SOD1 (G93A) y otros modelos de ALS14,18,19,39, permanecieron sin cambios y se agruparon con las muestras CTRL. En particular, el agrupamiento mostró un desplazamiento de puntos de datos masculinos de tres meses (3 M). Esto fue más prominente en los astrocitos, donde representó la mayor fuente de variabilidad (reflejada por la separación en PCA1). Al explorar la fuente de la variabilidad, identificamos un grupo menor de células dentro de los astrocitos y los oligodendrocitos, que solo estaba presente en los machos 3 M CTRL (Supp. Fig. 2). El grupo se caracterizó por la expresión de los genes relacionados con el estrés Cdkn1a y Fkbp5, que tenían los valores más extremos de cargas en los componentes principales respectivos (PC) en el análisis pseudobulk, lo que confirma el efecto del grupo en el desplazamiento de 3 M CTRL macho puntos de datos. Como la presencia del grupo tuvo un efecto insignificante en el análisis posterior, lo consideramos un artefacto técnico del procesamiento de muestras y lo eliminamos del conjunto de datos. Este hallazgo, sin embargo, mostró el poder del análisis de una sola célula para caracterizar incluso cambios menores en las subpoblaciones de células, que de otro modo podrían ser difíciles de interpretar en el análisis masivo tradicional.

El análisis de expresión diferencial y pseudobulk revela solo cambios menores en la expresión génica. ( a ) Comparación de agrupamiento de PCA pseudobulk de muestras masculinas y femeninas que muestran una reacción compartida a la patología en curso en microglia y oligodendrocitos a 4 M. ( b ) Una visualización de los pocos genes expresados ​​​​diferencialmente que se encuentran desregulados en hombres y mujeres en todos los tipos de células en Punto de tiempo de 4 M. Xist distingue claramente las células femeninas, mientras que Eif2s3y y Uty se expresan en el cromosoma Y masculino. (c) Los resultados de la DEA que comparan muestras de CTRL y SOD1 4 M muestran un número limitado de genes regulados al alza y a la baja en la etapa final. ( d ) Curvas de enriquecimiento que visualizan los resultados de la GSEA a 4 M. Un conjunto de genes de referencia se enriqueció entre genes regulados a la baja en oligodendrocitos. El análisis de los términos GO mostró que los componentes mitocondriales se enriquecen entre los genes regulados al alza en los oligodendrocitos y la microglía.

Con base en las diferencias relacionadas con el sexo en las pruebas de comportamiento (Fig. 1a-d), examinamos las posibles variaciones de expresión génica asociadas a ALS entre los sexos por DEA, y comparamos las células masculinas y femeninas para CTRL y SOD1 por separado. El análisis arrojó solo unos pocos DEG basados ​​en los umbrales establecidos de |log2FC|> 1 y padj < 0,05. El gen Xist del cromosoma X estaba significativamente regulado en las hembras en los tres tipos de células, independientemente del genotipo. El gen Xist juega un papel importante en la compensación de la dosis del gen en las mujeres al silenciar uno de los cromosomas X y, por lo tanto, se expresa solo en las células femeninas40. Dos genes codificados por el cromosoma Y (Eif2s3y, Uty) aumentaron en los machos, pero la diferencia en su expresión solo superó el umbral log2FC en los astrocitos (Fig. 3b). Aparte de estos, no se encontraron en nuestros datos otros genes desregulados relacionados con la progresión de la patología y el sexo.

Para investigar los cambios transcripcionales relacionados con la enfermedad, realizamos la DEA en las comparaciones de muestras de CTRL y SOD1 en cada momento y para cada tipo de célula, considerando machos y hembras juntos. El gen Sod1 fue el único DEG significativamente regulado al alza en todas las etapas medidas de la enfermedad, incluida la etapa final, como se muestra en la Fig. 3c y Supp. Pestaña. 1 (|log2FC|> 1, padj < 0,05), lo que confirma la validez del modelo SOD1(G93A). Otros genes desregulados eran en su mayoría transcritos ribosómicos o no codificantes que evadían el control de calidad. Además, las muestras de 4 M CTRL se caracterizaron por una mayor expresión de los genes Cdk8 y Cmss1 en todos los tipos de células. Estos dos genes se identificaron en el análisis posterior como factores de confusión que afectan negativamente los resultados de la subagrupación (suplemento Fig. 2a, b). Por lo tanto, se consideraron factores de sesgo sin conexión con la patología similar a la ELA. Juntos, estos resultados muestran una variación mínima en la expresión génica relacionada con la progresión de la patología en la corteza del ratón SOD1 (G93A), independientemente del sexo, con la indicación de cambios sutiles en la microglía y los oligodendrocitos en la fase tardía de la enfermedad.

Para investigar la importancia biológica potencial de los cambios mínimos en la expresión génica detectados por DEA, utilizamos el GSEA32 centrado en el punto de tiempo de 4 M más afectado. Como GSEA considera la expresión de todos los genes, independientemente de los cortes en log2FC o el valor p, permite encontrar cualquier proceso desregulado incluso si el cambio de los genes individuales es menor.

Primero, empleamos un enfoque de metanálisis y recopilamos las firmas genéticas de las células gliales afectadas por la mutación SOD1 de 15 estudios transcriptómicos publicados en los últimos 20 años (Tabla complementaria 2). Este conjunto incluye datos derivados principalmente de la médula espinal del modelo SOD1 (G93A). Usando GSEA, detectamos el enriquecimiento de un solo conjunto de genes que Liu, et al.15 informaron recientemente como regulado a la baja en los oligodendrocitos del tronco encefálico en ratones de 100 días de edad. En concordancia, nuestros resultados mostraron un enriquecimiento negativo en oligodendrocitos (NES = − 1.32, padj = 6.3 × 10 − 3; NES: puntaje de enriquecimiento normalizado; Fig. 3d), lo que indica cambios pequeños pero significativos en los oligodendrocitos corticales 4 M SOD1. No se encontró ningún conjunto de genes enriquecido para microglia o astrocitos.

Además del metanálisis, también buscamos términos de Gene Ontology (GO) 41,42 enriquecidos en nuestros datos. Dos términos activados relacionados con las mitocondrias resultaron estar regulados al alza en nuestro conjunto de datos: envoltura mitocondrial en oligodendrocitos (NES = 1,11, padj = 8,2 × 10–3) y complejo que contiene proteína mitocondrial en microglía (NES = 1,73, padj = 1,1 × 10-6) (Fig. 3d). En apoyo de nuestros datos, la disfunción mitocondrial se ha discutido ampliamente como uno de los factores que contribuyen a la patología de la ELA, no solo en relación con el gen mutante Sod1, sino también con otras perturbaciones genéticas relacionadas con la ELA (revisado en Jankovic et al.43) .

En conjunto, a pesar del bajo número de DEG, identificamos cambios sutiles en la función de las mitocondrias en los oligodendrocitos corticales y la microglía. Sin embargo, considerando el número de términos enriquecidos y su significado, la gravedad de la disfunción es bastante baja.

Como los análisis pseudobulk revelaron solo variaciones sutiles en la expresión génica de la glía cortical SOD1 (G93A), especulamos que los cambios patológicos podrían estar representados por una pequeña fracción de células, ocultas a nivel de población. Por lo tanto, llevamos a cabo un análisis de subgrupos en profundidad con el objetivo de identificar las subpoblaciones que podrían desempeñar un papel en la progresión de la enfermedad.

Comenzando con los astrocitos, identificamos tres grupos que estaban presentes en las muestras de CTRL y SOD1 en una proporción similar (Fig. 4a). Para anotar estos grupos, calculamos sus genes marcadores (Supp. Tab. 3) y visualizamos las firmas genéticas de los subtipos astrocíticos descritos por Habib et al.5 en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer (EA). El estudio identificó dos subpoblaciones similares de astrocitos que expresan marcadores de reactividad:⁠ Gfap-High y DAA. Si bien Gfap-high estuvo presente en los controles y en las muestras de EA, los AAD fueron exclusivos del modelo de EA, y los autores sugirieron su papel potencial en la progresión de la enfermedad. Los genes marcadores del grupo 3 en nuestros datos se superpusieron parcialmente con los marcadores del grupo Gfap-High (por ejemplo, genes Mt1, Mt2, Id3, Cd9, Vim), pero no detectamos los DAA específicamente en muestras SOD1. Es de destacar que los niveles de expresión de Gfap y Vim fueron bajos, lo que sugiere una reacción patológica limitada de los astrocitos en la corteza de los ratones mutantes SOD1 (G93A). Este hallazgo concuerda con los resultados del análisis pseudobulk, que no muestra cambios en los astrocitos. El grupo 1 compartió genes comunes con astrocitos Gfap-bajos (p. ej., Luzp2, Trpm3), y el grupo 2 restante expresó marcadores de grupos Gfap-Alto y Gfap-Bajo, por lo que representa un grupo de estado intermedio.

El análisis de subpoblaciones reveló una subpoblación única de oligodendrocitos en las muestras de SOD1. Visualización UMAP de subpoblaciones de astrocitos (n = 5292) (a), microglía (n = 8414) (b) y oligodendrocitos (n = 5876) (c) divididos en condición CTRL y SOD1 (izquierda), incluidas células de los cuatro puntos de tiempo. Las firmas de expresión génica de las subpoblaciones descritas anteriormente se muestran proyectadas en UMAP (parte superior central). Una lista de marcadores de clúster representativos utilizados para su anotación (centro-abajo). Proporciones de subpoblaciones en CTRL y SOD1 (derecha), incluidas celdas de los cuatro puntos temporales. ( d ) Visualización UMAP de oligodendrocitos CTRL y SOD1 divididos según la edad (1 M: n = 682, 2 M: n = 1697, 3 M: n = 1430, 4 M: n = 2067). El gráfico de barras muestra las proporciones de las subpoblaciones en cada momento.

Microglia se agruparon en cuatro grupos como se muestra en el gráfico UMAP en la Fig. 4b. El grupo 1 se caracterizó por la expresión de marcadores homeostáticos3,36,37. Las firmas genéticas de la microglía en los grupos 2 y 3 se parecían al perfil de expresión de ARM, que se describió en un modelo de EA, pero también en menor proporción en un cerebro sano3,4. Estas microglías activadas característicamente regulan a la baja genes homeostáticos como Cx3cr1, P2ry12 y Sall1, lo que también se nota en nuestros datos (Fig. 4b). Además, el grupo 3 estuvo marcado por una mayor expresión de Apoe, que es un importante regulador del fenotipo neurodegenerativo microglial44. El grupo 4 representaba a IRM4 y se distinguía claramente por la expresión de Ifit2, Ifit3 e Ifitm3, los genes implicados en la vía de respuesta del interferón. Sin embargo, la proporción de IRM fue muy baja en ambas condiciones. Sin embargo, detectamos un pequeño aumento en la subpoblación de microglía activada en muestras de SOD1 (grupo 2), lo que sugiere una activación inicial de microglía en respuesta a estímulos patológicos.

Los oligodendrocitos formaron cuatro grupos (Fig. 4c). El grupo 1 compartió una firma de expresión génica similar con los oligodendrocitos formadores de mielina (MFOL) descritos por Marques, et al.35, incluida la expresión de los genes Mal, Plp1, Mog y Opalin. Estas células estaban predominantemente presentes en el punto de tiempo de un mes (1 M) (Fig. 4d), que coincide con la extensa mielinización en roedores durante las primeras semanas después del nacimiento45. El grupo 2 representa los oligodendrocitos maduros (MOL2) que expresan Klk6, pero también el marcador de oligodendrocitos maduros Apod y los genes típicos de las células mielinizantes Pmp22, S100b y Apc7,35,46. Floriddia et al.7 informaron que la población MOL2 es más abundante en la sustancia blanca de la médula espinal, pero también en menor medida en la corteza35. Las proporciones en ambas condiciones fueron similares para los grupos 1 y 2. En cuanto a los grupos 3 y 4, mostraron una mayor expresión de varios genes encontrados en poblaciones de oligodendrocitos maduros MOL5/67,35. Curiosamente, el grupo 4 estuvo presente casi exclusivamente en las muestras de SOD1 (Fig. 4d) y se caracterizó por una mayor expresión de Apoe e Il33. Il33 está regulado al alza en oligodendrocitos y astrocitos en lesiones y puede ser liberado por células estresadas o dañadas. Tiene un efecto antiinflamatorio y promueve la activación de la microglía (revisado en Sun et al.47). La regulación al alza de Ill33 se informó previamente en oligodendrocitos asociados a la enfermedad en un modelo de ratón de AD48,49. Apoe fue identificado como un gen marcador de oligodendroglia inmune (ImOLG)50, que se enriqueció en lesiones de esclerosis múltiple, lo que sugiere su papel en la desmielinización crónica y los continuos intentos de remielinización51. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el grupo 4 representa un estado dañado o reactivo de los oligodendrocitos, respondiendo a los estímulos patológicos en la corteza 4 M SOD1. Es tentador especular si el pequeño aumento en el número de microglia activada y posiblemente el cambio al estado intermedio en los astrocitos que observamos en SOD1 (Fig. 4a, b, respectivamente) podría ser una respuesta a los oligodendrocitos dañados/activados. Este tipo de interacción entre estados asociados a la enfermedad de las células gliales se describió recientemente en AD52 y también en ALS2.

En general, pudimos identificar múltiples subpoblaciones de astrocitos, microglía y oligodendrocitos, y reconocimos los patrones de expresión génica de subtipos celulares específicos descritos anteriormente. Sin embargo, en contraste con nuestras expectativas, no detectamos ninguna subpoblación asociada a la enfermedad en las muestras de SOD1, aparte de los oligodendrocitos dañados/activados.

Los resultados del análisis scRNA-seq sugirieron cambios menores en la glía cortical del modelo de ratón SOD1 (G93A). Para explorar más a fondo y validar esta conclusión, llevamos a cabo un análisis inmunohistoquímico de la glía en la corteza somatosensorial primaria y motora (la región idéntica utilizada para la secuenciación) en el punto temporal de 4 M, cuando los cambios fenotípicos son más pronunciados. Las zonas fotografiadas dentro de las áreas de interés se representan en la Fig. 5a. Como los cambios morfológicos están bien descritos en la médula espinal, también teñimos la región lumbar de la médula espinal en la etapa final (4 M) y usamos esas imágenes como referencia para la gliosis avanzada en nuestros animales.

La inmunohistoquímica (a) Una caricatura superior muestra 12 áreas escaneadas para la investigación de cambios morfológicos y cuantificación de APC y CC3. El dibujo inferior muestra 24 áreas escaneadas para el análisis de MBP. ( b ) El análisis de fluorescencia no reveló diferencias significativas en la morfología entre los astrocitos corticales en animales SOD1 (n = 6) y CTRL (n = 6). ( c ) Las imágenes representativas de la tinción de ALDH1L1 en la corteza y la médula espinal que comparan los astrocitos muestran una diferencia morfológica entre SOD1 y CTRL en la médula espinal, pero ninguna diferencia notable en la corteza. ( d ) Los resultados del análisis de Sholl indicaron una complejidad de microglía muy similar en las muestras CTRL (n = 6) y SOD1 (n = 6). Las máscaras de Scholl con radios concéntricos rojos representan microglía de umbral único tal como se usaron para el análisis. ( e ) Las imágenes representativas de cortes corticales y espinales teñidos con IBA1 muestran una morfología amebiana evidente de la microglía espinal, pero solo cambios morfológicos sutiles representados por extremos bulbosos (ver de cerca) en la corteza. ( f ) La cuantificación de MBP en la corteza reveló una diferencia insignificante entre SOD1 (n = 6) y CTRL (n = 6). El número de células APC + fue consistente entre SOD1 (n = 3) y CTRL (n = 3) y el número de células APC + coteñidas con CC3 utilizado como marcador de apoptosis en oligodendrocitos también permaneció similar, lo que sugiere que no hay oligodendrocitos aparentes. degeneraciones ( g ) Imágenes representativas de barras de escala de tinción de MBP, APC y CC3, 20 μm. La significación estadística se determinó utilizando la prueba t no pareada. Las barras de error representan SEM. n indica el número de animales utilizados.

Los astrocitos se tiñeron con el marcador ALDH1L1, lo que permitió la inspección de la morfología celular completa, incluidos los procesos. La astrogliosis, un cambio morfológico marcado por el agrandamiento del cuerpo celular y procesos acortados y engrosados, es una respuesta característica de los astrocitos en estados patológicos, y fue bien descrita en la médula espinal de la ELA13,14. En la corteza, realizamos un análisis de fluorescencia para encontrar diferencias morfológicas (Fig. 5b), pero el análisis mostró valores de fluorescencia muy similares de los astrocitos SOD1 y CTRL, lo que sugiere que no hay agrandamiento celular asociado con la activación. La morfología similar se puede ver en la Fig. 5c en comparación con los astrocitos en los cuernos ventrales de la región espinal lumbar, que mostraban un cuerpo agrandado con procesos distintivamente acortados. Los resultados del análisis de fluorescencia se alinean con poco o ningún cambio detectado en los astrocitos a nivel de expresión génica.

La microglía, al igual que los astrocitos, cambia su morfología en respuesta a estímulos patológicos. Retraen procesos y adoptan una forma amebiana específica, típica de su estado activado. Para visualizar la microglía, usamos el anticuerpo IBA1 y teñimos tanto la corteza como la médula espinal lumbar para comparar. El análisis de Sholl que usamos para evaluar los cambios en la morfología (Fig. 5d) se realiza con frecuencia para cuantificar la complejidad de la arborización de las células. El análisis confirmó que la morfología de la microglía cortical SOD1 no difiere significativamente de la de los animales CTRL. No detectamos procesos más cortos o ramificación reducida, lo que sugeriría un fenotipo activado. Sin embargo, durante el análisis notamos que algunas puntas de los procesos se veían bulbosas y agrandadas (Fig. 5e). Estas estructuras, denominadas extremos bulbosos, aparecen como la primera reacción de la microglía después de la lesión53 y pueden representar una fase inicial de activación de la microglía observada en los datos transcriptómicos. La microglía SOD1 en los cuernos ventrales de la médula espinal, por otro lado, muestra la típica forma amebiana con procesos muy cortos y engrosados ​​asociados con la activación.

El análisis anterior identificó un grupo de oligodendrocitos específico de SOD1 (grupo 4) que sugiere que una cierta porción de células está apoptótica, por lo que nos enfocamos en los cambios de expresión de proteínas relacionados con la desmielinización crónica, la necrosis o la apoptosis. En consecuencia, teñimos para proteína básica de mielina (MBP), un marcador de mielinización, poliposis coli adenomatosa (APC), un marcador de oligodendrocitos adultos, y caspasa 3 escindida (CC3), un marcador apoptótico. La cuantificación de la intensidad de la señal de MBP, así como la cantidad de oligodendrocitos APC + en la corteza de los animales SOD1, excluyó los procesos de desmielinización ya que no hubo una disminución significativa de las células MBP o APC + en comparación con los CTRL (Fig. 5f). De manera similar, la tinción conjunta de CC3 con APC no reveló una abundancia diferente de oligodendrocitos CC3 + en SOD1 o CTRL, lo que sugiere una tasa similar de apoptosis (Fig. 5f). La tinción de MBP y la imagen representativa de una célula positiva para APC y CC3 se pueden encontrar en la Fig. 5g. En conjunto, los datos no mostraron una desmielinización o degeneración significativa de los oligodendrocitos, por lo que es probable que el grupo 4 específico de SOD1 identificado en scRNA-seq en 4 M animales no represente células muertas o dañadas.

En conjunto, no detectamos cambios morfológicos profundos en la glía cortical de los ratones SOD1. Los oligodendrocitos no mostraron un aumento de la muerte celular o pérdida de la proteína MBP, lo que sugiere que se mantuvo su función en la corteza de los ratones con ELA.

La ELA es una enfermedad neurodegenerativa devastadora con una progresión rápida y sin estrategias de tratamiento efectivas. Aunque se reconoce principalmente como una enfermedad de las neuronas motoras, los otros tipos de células, incluidas las células gliales, contribuyen a la progresión de la enfermedad y, por lo tanto, representan un objetivo potencial para futuras terapias. En el pasado se han desarrollado múltiples modelos experimentales para comprender los mecanismos de la enfermedad, así como para facilitar la búsqueda de dianas terapéuticas. Entre ellos, el modelo de ratón SOD1 (G93A) tiene la posición principal como la cepa de ratón mejor caracterizada utilizada en la investigación actual de ALS. A pesar de su aplicación a largo plazo, el efecto de los cambios patológicos en diferentes regiones del SNC aún no se comprende por completo.

El efecto patológico sobre la corteza es de especial interés por su papel en la planificación, control y ejecución de los movimientos voluntarios, que se ven gravemente afectados por la ELA. Se han informado cambios patológicos en la corteza de los pacientes con ELA desde la primera descripción de la enfermedad en 1869, y el seguimiento de las anomalías estructurales corticales se convirtió en un procedimiento estándar de diagnóstico de la ELA54. Junto con la muerte de MN cortical, también se han observado cambios en la glía, incluida la microgliosis11,55,56,57, acompañada de la firma de expresión génica similar a DAM56, desmielinización8 y cambio de la función de los oligodendrocitos de mielinizante a neurosoporte57.

Si bien los cambios están bien documentados en humanos, se sabe menos sobre el efecto de la patología similar a la ELA en la corteza de los modelos SOD1. En el modelo SOD1(G93A), la degeneración del MN cortical fue observada tempranamente por Özdinler et al.17 y otros, junto con los cambios en la glía18,19,20. Se demostró que los astrocitos reactivos en la corteza SOD1 (G93A) difieren de sus contrapartes espinales, mientras que aún mantienen un efecto tóxico en las neuronas18,19,58. Sin embargo, Gomes et al.19 tampoco informaron cambios significativos en la expresión génica en microglía u oligodendrocitos. Además, otros sugirieron que la patología en el modelo SOD1 estaba restringida solo a las neuronas motoras espinales y bulbares, sin afectar la corteza motora21. Por lo tanto, tales datos opuestos plantean preguntas sobre hasta qué punto la corteza se ve afectada en el modelo de ratón SOD1 y qué tan bien este modelo recapitula la patología cortical en humanos.

Para llenar este vacío de conocimiento, aplicamos secuenciación de ARN de una sola célula respaldada por inmunohistoquímica para detectar cambios en la expresión génica, la presencia de poblaciones de células asociadas a enfermedades y modificaciones morfológicas u otras modificaciones patológicas en la glía cortical que acompañan a la patología similar a ALS en SOD1. G93A) modelo de ratón. El fenotipo similar a la ELA se confirmó mediante pruebas de comportamiento, incluidas las diferencias dependientes del sexo en la progresión de la enfermedad según lo informado por McCombe y Henderson38. Los resultados de scRNA-seq centrados en la glía revelaron cambios menores en la microglía y los oligodendrocitos, y no mostraron cambios significativos relacionados con la ELA en los astrocitos, lo que contradice varios estudios que informan sobre el fenotipo reactivo de los astrocitos18,19,58. Aunque el único gen significativamente desregulado en el modelo SOD1 (G93A) fue Sod1, GSEA indicó la disfunción mitocondrial en microglia y oligodendrocitos. Cambios similares han sido observados recientemente por Liu et al.15 en los oligodendrocitos aislados del tronco encefálico de ratones SOD1 de 100 días de edad, lo que sugiere una posible desregulación de las vías energéticas.

Como nuestros datos se generaron dentro de la corteza somatosensorial primaria y motora, que representa una región de punto final del tracto corticoespinal afectado por la ELA, permiten abordar preguntas básicas sobre el sitio de origen y la dirección de la progresión de la ELA. Actualmente, hay dos hipótesis, ambas respaldadas por líneas de evidencia (revisadas en van den Bos et al.59). La hipótesis de la 'muerte hacia adelante' sugiere que la ELA se origina en la corteza y se propaga hacia los MN espinales. Por otro lado, la hipótesis de la 'muerte hacia atrás' propone que la ELA comienza dentro de los músculos o las uniones neuromusculares. Teniendo en cuenta el fenotipo avanzado similar a la ELA de los ratones SOD1 en etapa terminal y los cambios más pronunciados en el tronco encefálico y la médula espinal observados en otros lugares, los cambios más leves en la corteza indicados por nuestros datos están más a favor de la hipótesis de la "muerte retrógrada". en ratones SOD1 (G93A). Curiosamente, esto contrasta con un informe de Burg et al.60, que indica que la corteza es el punto de inicio de la ELA en ratones SOD1 (G86R). Los datos contradictorios podrían sugerir un efecto diferencial de mutaciones puntuales específicas en el carácter de la enfermedad, lo que requiere una mayor investigación.

Muchos de los informes anteriores que exploran el efecto de la mutación SOD1 en la corteza motora se basaron en la medición del número limitado de genes y proteínas19,20,55, o en el análisis de la población total de células18,61. En consecuencia, esto disminuyó la sensibilidad del análisis y limitó la interpretabilidad de los datos. En este estudio, utilizamos scRNA-seq de alto rendimiento, lo que permite un análisis en profundidad de poblaciones de células pequeñas que no se pueden distinguir mediante enfoques masivos. Usando scRNA-seq, estudios seminales recientes revelaron varias poblaciones de glía asociadas a la enfermedad, que desempeñan un papel importante en la progresión de la enfermedad3,4,5,6. Curiosamente, muchas de estas poblaciones están presentes en múltiples enfermedades, lo que sugiere mecanismos comunes empleados por las células gliales en respuesta a estímulos patológicos. Por ejemplo, se identificó una población similar a DAM no solo en la enfermedad de Alzheimer, sino también en la médula espinal del ratón SOD1 (G93A)3 y en un modelo de lesión de la médula espinal62. En nuestro trabajo, buscamos estas poblaciones sin ningún éxito, lo que confirmó los cambios mínimos observados a nivel transcripcional masivo, así como por inmunohistoquímica. En su mayoría, encontramos una composición celular similar entre los animales de control y SOD1 (G93A), a excepción de la microglía y los oligodendrocitos. En el caso de la microglía, observamos un pequeño aumento en la proporción de microglía activada, lo que sugiere una fase inicial de su activación. Los datos fueron completados por inmunohistoquímica revelando extremos bulbosos en procesos microgliales. Se observaron cambios más aparentes en los oligodendrocitos, donde el análisis de subagrupación identificó la existencia de una población única de oligodendrocitos, caracterizada por una mayor expresión de Apoe e Il33, y enriquecida específicamente en muestras de 4 M SOD1. Teniendo en cuenta que no hay una pérdida profunda de oligodendrocitos o una tasa apoptótica más alta en inmunohistoquímica, podríamos especular sobre el papel activo de esta población de oligodendrocitos en la progresión de la enfermedad. Esto también está en línea con la evidencia reciente que sugiere el papel activo de los oligodendrocitos en la progresión de la esclerosis múltiple6 y en el envejecimiento de la sustancia blanca63, lo que contrasta con su papel pasivo ampliamente aceptado. En particular, no observamos ningún patrón de expresión similar a los oligodendrocitos asociados a enfermedades informados anteriormente6,48,49,50, excepto Apoe o Il33 mencionados anteriormente. Sin embargo, esto podría estar relacionado con los leves cambios generales en la expresión génica observados a lo largo de nuestros datos.

En conclusión, nuestro estudio demuestra que la glía cortical solo se ve afectada sutilmente en el modelo SOD1 (G93A), incluso en la etapa final de la enfermedad. Además, debido al poder de scRNA-seq, demostramos que los oligodendrocitos participan potencialmente activamente en la patología, enfatizando la importancia de abordar su papel en futuras investigaciones. Finalmente, al reflexionar sobre nuestros resultados, sugerimos que el modelo de ratón SOD1 (G93A) no recapitula completamente la enfermedad humana y recomendamos utilizar un sistema de modelo diferente para estudiar la patología cortical de la ELA.

Colectivamente, nuestros resultados sugieren que los cambios patológicos similares a ALS presentes en la corteza sensoriomotora de los ratones SOD1 (G93A) son mínimos. Existe una discusión en curso en el campo sobre si el modelo imita la enfermedad por completo, incluida la patología que ocurre en la corteza, y los resultados publicados son discutibles. Nuestros hallazgos colectivos al inspeccionar las células gliales en múltiples niveles no revelaron cambios significativos en los astrocitos SOD1 y solo cambios sutiles en la microglía y los oligodendrocitos en la etapa final. Los cambios de microglía y oligodendrocitos sugieren iniciar una activación ligada a la patología, pero el grado de cambio no corresponde a la patología descrita en tejido humano. Los oligodendrocitos específicos de SOD1 identificados en la etapa final, sin embargo, contribuyen a la evidencia publicada recientemente que informa su papel activo en la neurodegeneración, rechazando en gran medida el dogma de larga duración que presenta a los oligodendrocitos como únicamente pasivos en las enfermedades del SNC. Sin embargo, a pesar de los signos de activación, el efecto de la patología similar a la ELA en las células gliales en la corteza de los ratones SOD1 (G93A) es menor y nuestros datos brindan evidencia contra el uso de este modelo para estudiar la patología cortical de la ELA.

Los datos de scRNA-seq generados durante este estudio actual están disponibles en Gene Expression Omnibus64 de NCBI y se puede acceder a ellos a través del número de acceso de GEO Series GSE206330 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc =GSE206330).

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Los autores desean agradecer a Helena Pavlikova y Marketa Hemerova por su excelente asistencia técnica ya Frances Zatrepalkova por corregir el manuscrito. Este estudio fue apoyado por subvenciones 23-05327S y 19-02046S de la Fundación Checa para la Ciencia, por la Agencia de Subvenciones de la Universidad Charles (Número de Subvención 158320), por el apoyo institucional RVO 86652036, por MEYS CR (CZ.1.05/1.1.00/ 02.0109), por la Academia Checa de Ciencias (Estrategia AV21, número de subvención VP29), por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el EJP RD COFUND- EJP N° 825575 y por EU – Next generation EU, LX22NPO5107 (MEYS). La microscopía se realizó en el Centro de Servicio de Microscopía del Instituto de Medicina Experimental CAS con el apoyo del MEYS CR (LM2023050 Czech-Bioimaging).

Estos autores contribuyeron por igual: Tereza Filipi y Zuzana Benesova.

Departamento de Neurofisiología Celular, Instituto de Medicina Experimental, Academia Checa de Ciencias, Videnska 1083, 14220, Praga, República Checa

Tereza Filipi, Ondrej Vanatko, Jana Tureckova, Monika Kubiskova, Denisa Kirdajova y Miroslava Anderova

Segunda Facultad de Medicina, Universidad Charles, V Uvalu 84, 15006, Praga, República Checa

Tereza Filipi y Ondrej Vanatko

Laboratorio de Expresión Génica, Instituto de Biotecnología CAS, BIOCEV, Prumyslova 595, 25250, Vestec, República Checa

Zuzana Matusova, Pavel Abaffy, Sarka Benesova y Lukas Valihrach

Facultad de Ciencias, Universidad Charles, Albertov 6, 12800, Praga, República Checa

Zuzana Matusova

Departamento de Informática y Química, Facultad de Tecnología Química, Universidad de Química y Tecnología, Technicka 5, 16628, Praga, República Checa

sarka benesova

Departamento de Organización Funcional de Biomembranas, Instituto de Medicina Experimental, Academia Checa de Ciencias, Videnska 1083, 14220, Praga, República Checa

Jakub Zahumensky

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TF y ZM interpretaron los datos, escribieron el manuscrito y prepararon todas las figuras. TF, ZM, PA, OV, JT, MK y DK realizaron experimentos. TF, ZM, PA, LV, JT,. OV y SB analizaron los datos. JZ escribió una macro para el análisis inmunohistoquímico. MA y LV concebido y supervisado el estudio. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Lukas Valihrach o Miroslava Anderova.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Filipi, T., Matusova, Z., Abaffy, P. et al. La glía cortical en ratones SOD1 (G93A) se ve sutilmente afectada por una patología similar a la ELA. Informe científico 13, 6538 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33608-y

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Recibido: 25 de octubre de 2022

Aceptado: 15 de abril de 2023

Publicado: 21 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33608-y

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